Construction des sondes BRET² de PI3K

Pour générer des biosenseurs BRET mesurant l’activité de la PI3K, il nous a fallu fusionner les séquences ADNc codant pour les donneurs et accepteurs d’énergie BRET, respectivement la Rluc8 et la GFP2, aux ADNc codants pour les isoformes des sous-unités catalytiques (p110) et régulatrices (p101 ou p87) de PI3K. Nous avons choisi de fusionner les sondes d’énergie BRET indifféremment en position N-terminale ou C-terminale de chaque sous-unité. Ce choix a été fait pour trois raisons : i/ il est plus aisé de fusionner des étiquettes

protéiques aux extrémités d’une protéine d’intérêt plutôt qu’au sein même de sa séquence, auquel cas les risques d’altération de la fonction de la protéine finale sont souvent plus importants ; ii/ la fusion de différents types d’étiquettes, notamment des fluorophores qui sont des protéines d’environ une trentaine de kDa, aux extrémités N- et C-terminales des différentes sous-unités de PI3K a déjà été réalisée et validée pour l’étude de ces protéines [84, 174] ; iii/ nous n’avons aucune idée des arrangements moléculaires adoptés par les dimères p110/p87, d’une part, et p110/p101, d’autre part, à l’état basal comme à l’état actif, étant donné qu’il n’existe aucun cristal de ces différents dimères. Il n’y a donc pas de logique à étiqueter un couple de sous-unité PI3K plus en N- qu’en C-terminal.

Pour fusionner le donneur et l’accepteur d’énergie aux sous-unités de PI3K, nous avons amplifié les séquences codantes des sous-unités p110, p87 et p101 par PCR en utilisant des amorces sens et anti-sens contenant les sites de restriction enzymatiques spécifiques au vecteur de clonage dans lequel elles seront insérées. Une fois amplifiées, les séquences codantes des différentes sous-unités des PI3K ont été insérées dans le site multiple de clonage de différents vecteurs (Tableau 4) qui sont : pGFP2-N ou pGFP2-C pour une fusion des protéines avec l’accepteur d’énergie en position C-terminale et N-terminale respectivement, le vecteur pRluc8-N pour une fusion avec le donneur d’énergie en position C-terminale, et le vecteur pcDNA3.1-Rluc8, que j’ai préalablement construit en insérant la séquence codante de la Rluc8 délétée de son codon STOP dans un plasmide pcDNA3.1, pour une fusion avec le donneur d’énergie en position N-terminale. A titre d’exemple, la Figure 27 représente les cartes des plasmides provenant du clonage de la p110 dans pGFP2-C3 et pRluc8-N1 (Figure 27). Nous avons ainsi obtenu au total 9 constructions : p110-Rluc8, p110-GFP2, GFP2-p110, p87-Rluc8, Rluc8-p87, p87-GFP2, GFP2-p87, p101-GFP2 et GFP2-p101 (Figure 28 A-C). Par manque de temps, nous ne sommes pas parvenus à construire les protéines de fusion Rluc8-p110Rluc8-p101 et p101-Rluc8. Les 9 constructions obtenues permettent de tester 8 combinaisons de biosenseurs BRET en associant les différentes constructions de la sous-unité catalytique p110 aux constructions de sous-unités p87 ou p101 dont les partenaires BRET sont complémentaires : p110-Rluc8/p87-GFP2, p110-Rluc8/GFP2-p87, p110-GFP2/p87- Rluc8, GFP2-p110/p87-Rluc8, p110-GFP2/Rluc8-p87, GFP2-p110/Rluc8-p87, p110- Rluc8/p101-GFP2 et p110-Rluc8/GFP2-p101, (Figure 28D).

Tableau 4 : Résumé des conditions utilisées pour les constructions des fusions.

Amorces sens (PS) et anti-sens (PAS) : en bleu sont indiquées les bases correspondant aux sites de restriction enzymatiques utilisés. En vert sont indiquées les séquences KOZAK ajoutées pour diriger la traduction à partir de l’ATG. En rouge sont indiquées les bases complémentaires des gènes codant pour Rluc8, p110, p87 ou p101 (18 bases minimum) avec ou sans le codon STOP (en gras) selon que la fusion est respectivement en N-terminal ou C- terminal du gène.

Figure 27 : Exemples de cartes vectorielles de constructions BRET.

Schémas des cartes vectorielles de deux de nos constructions : GFP2-p110 (A) et p110-Rluc8 (B). pCMV : promoteur cytomegalovirus, Kan/neo R ou zeo R : gènes de résistance à la kanamycine/néomycine ou zeocine.

Construction Amorces

Sites de restriction

5’ et 3’

Vecteur de clonage

pcDNA3.1-Rluc8 PS : GGA AGA TGG CTA GCGGCC GCC ACCATG GCT TCC AAG GTG TAC

PAS : TAT TATGGT ACCCTG CTC GTT CTT CAG CAC Nhe I / Kpn I pcDNA3.1 (+)

p110-Rluc8 PS : CCT CGA GGGGCC GCC ACCATG GAG CTG GAG AAC TAT

PAS : GGG GTA CCC GGCTGA ATG TTT CTC TCC TTG Xho I / Kpn I pRluc8-N1

p110-GFP2 PS : CCGCTC GAGGCC GCC ACCATG GAG CTG GAG AAC TAT

PAS : GGG TAC CCC GGCTGA ATG TTT CTC TCC TTG Xho I / Kpn I pGFP2-N1

GFP2-p110

PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG CTG GAG AAC TAT AAA CAG

PAS : CCT TAT GCC CGC GGTTTA GGC TGA ATG TTT CTC TCC TTG

Xho I / Sac II pGFP2-C3

p87-Rluc8 PS : CCA AGC TTGGCC GCC ACCATG GAG AGC TCA GAT GTG

PAS : GGG GTA CCC TTG GATGAT GCC AGA GAA TGT GTT Hind III / Kpn I pRluc8-N1

Rluc8-p87

PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG AGC TCA GAT GTG

PAS : CCT TAT GGG TTT AAA CGGTTA TTG GAT GAT GCC AGA GAA

Xho I / Pme I pcDNA3.1-Rluc8

p87-GFP2 PS : CCCAAG CTTGCC GCC ACCATG GAG AGC TCA GAT GTG GAG

PAS : GGG TAC CCCTTG GAT GAT GCC AGA GAA TGT G Hind III / Kpn I pGFP2-N1

GFP2-p87

PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGA ATG GAG AGC TCA GAT GTG

PAS : CCT TAT GCC CGC GGTTTA TTG GAT GAT GCC AGA GAA

Xho I / Sac II pGFP2-C3

p101-GFP2 PS : CCCAAG CTTGCC GCC ACCATG CAG CCA GGG GCC ACG

PAS : CGG AAT TCCGGG CAG AGC TCC ACT GAA AGT CAT GAT Hind III / EcoRI pGFP2-N1

GFP2-p101

PS : GGA TAT CGC TCG AGT TCA GCC GGA GGAATG CAG CCA GGG GCC ACG

PAS : CCT TAT GCC CGC GGTCTA GGG CAG AGC TCC ACT GAA

Figure 28 : Représentation schématique des sous-unités p110 (A), p87 (B) et p101 (C) fusionnées aux protéines Rluc8 et GFP2 et des différentes combinaisons BRET de sous-unités catalytiques et régulatrices possibles (D).