Le système de réparation des protéines oxydées

Il a récemment été montré que le domaine nDsbD était capable d’interagir avec le domaine N-terminal de la protéine PilB (Brot et al., 2006). Cette protéine, spécifique des bactéries du genre Neisseria, est impliquée dans les systèmes de réparation des protéines oxydées. En effet, elle possède deux domaines Méthionine sulfoxyde réductase capables de prendre en charge et de réparer les résidus méthionines sulfoxyde qui se forment sur les protéines sensibles aux espèces oxydantes. Ces dernières peuvent être produites, par exemple, par le système immunitaire de l’hôte du pathogène. En combattant les conséquences d’un métabolisme oxydant, une bactérie accroît ainsi sa pathogénicité.

IV.3.1. Oxydation des méthionines par les formes activées de l’oxygène (FAO)

Le métabolisme aérobie produit en permanence des formes activées de l’oxygène (FAO). Cette production de FAO est contrebalancée par des systèmes de défenses anti-oxydants (catalases, peroxydases, superoxyde dismutases…). Cependant, dans certaines conditions, cet équilibre peut être rompu, à la suite soit d’une augmentation de la production de FAO (exposition à des concentrations élevées en O2, infection bactérienne…), soit d’une diminution de l’efficacité des systèmes antioxydants. Ceci conduit alors à une augmentation des concentrations intracellulaires en FAO, appelée communément stress oxydant. Ces FAO vont réagir avec de nombreuses biomolécules, notamment avec l’ADN, les lipides ou encore les protéines, prenant part ainsi au processus du vieillissement cellulaire (Harman, 1981). Au niveau des protéines, un des acides aminés le plus sensible à l’oxydation par les FAO est la méthionine (Met).

Les Met vont être oxydées par deux mécanismes différents, impliquant une oxydation à un ou deux électrons. L’oxydation à deux électrons entraîne la formation d’un dication qui, en présence d’eau ou d’un réactif oxydant, va former la méthionine sulfoxyde (MetSO).

MetS MetS²⁺ + 2e

-MetS²⁺ + H2O MetS=O + 2 H⁺

L’oxydation à un électron entraîne la formation d’un radical cation. Cette espèce est très instable et peut être oxydée en sulfoxyde par certaines FAO via une oxydation à un électron (pour revue, voir Schoneich, 2005).

MetS + Ox Mets^.+ + Ox

.-MetS^.+ + Ox MetSO

Plusieurs entités oxydantes (Ox) vont être responsables de la formation de MetSO. On citera le peroxyde d’hydrogène (H2O2), le radical hydroxyle (OH^.), le peroxynitrite (HOONO).

IV.3.2. Conséquence de l’oxydation des méthionines

L’oxydation des Met peut conduire à la dégradation de la protéine en constituant un marqueur de reconnaissance pour le protéasome (Friguet et al., 2006). Ce phénomène, s’il est trop fréquent, peut donc être néfaste pour le métabolisme bactérien. Toutefois, l’oxydation des Met peut être aussi considérée comme une modification post-traductionnelle non enzymatique qui entraîne des changements des propriétés de ce résidu. En effet, la chaîne latérale de Met est plutôt hydrophobe et flexible. Au contraire, après oxydation en MetSO, la chaîne latérale devient plus polaire et plus encombrante. En fonction de la localisation des résidus Met oxydés, les conséquences peuvent être différentes.

Ainsi l’oxydation de Met enfouies au sein d’une protéine va engendrer des changements conformationnels locaux pouvant mener à l’altération, voire à la perte ou au gain de la fonction de certaines protéines. Par exemple (et pour n’en citer qu’un), la vitesse d’ouverture et de fermeture des canaux K+-dépendant est K+-dépendante de l’état d’oxydation de certains résidus Met (Ciorba et al., 1997). De plus, l’oxydation de résidus Met localisés à la surface de protéines peut avoir un rôle de protection pour ces protéines vis-à-vis d’un stress oxydant, en jouant un rôle préventif de tampon (Gitlin et al., 1996).

IV.3.3. Les méthionine sulfoxyde réductases (Msr)

Les Msr catalysent la réduction des MetSO en Met et sont donc impliquées dans la lutte contre le stress oxydant, le vieillissement cellulaire et dans la pathogénicité des bactéries. Il existe deux classes de Msr, A et B, permettant respectivement la réduction des deux diastéréoisomères (LS) et (LR) de MetSO. Dans le cas de PilB de Neisseriameningitidis, en plus d’un troisième domaine en position N-terminale, ces deux domaines MsrA et MsrB sont présents.

Les MsrA et les MsrB ont un mécanisme catalytique identique. Les MsrA et MsrB, caractérisées jusqu’ici, sont des enzymes contenant des Cys essentielles à leur fonction. Elles présentent toutes le même mécanisme catalytique faisant intervenir la chimie de l’acide sulfénique (Figure 18) (Boschi-Muller et al., 2000 ; Olry et al., 2002 et pour revue, voir Boschi-Muller et al., 2005).

IA S CH₃ OH R S S_R IB R S CH₃ S S_R O H H H₂O II S_C S_R III Trx S_C S_R

+

Figure 18 : Mécanisme catalytique des Msr à deux Cys. La formation du complexe Msrred/substrat n’est pas explicitée. L’étape MetSO réductase peut être divisée en deux sous-étapes. Le substrat sulfoxyde est attaqué par la Cys catalytique (SC) de la MetSO réductase lors de l’étape IA, conduisant à la formation d’un état de transition de type sulfurane. Ce sulfurane évolue selon l’étape IB pour aboutir au relargage du sulfure et à la formation de l’intermédiaire acide sulfénique, instable dans le milieu. L’attaque de la Cys de recyclage (SR) sur cet intermédiaire permet de former un pont disulfure intramoléculaire avec perte d’une molécule d’eau, lors de l’étape II. Enfin, le pont disulfure est réduit par Trx au cours de l’étape III (d’après Olry et al., 2002).

Pourtant ces deux protéines ne présentent aucune identité de séquence. Leurs structures tridimensionnelles s’avèrent être également différentes (Figure 19). Les Msr sont toutes deux des protéines monomériques de 170 à 211 résidus pour les MsrA et de 146 résidus pour les MsrB. Les aspects structuraux relatif aux Msr ne seront pas développés ici.

Figure 19 : Structures RX de la MsrA d’E. coli (résolue par Tête-Favier et al., 2000) et du domaine MsrB de PilB de N. gonorrhoeae (Lowther et al., 2002). Sont figurés les résidus cystéine. Les repliements de MsrA et MsrB sont effectivement très différents. Les numéros d’accès PDB sont les suivants : 1ff3 et 1l1d.

IV.3.4. Le domaine N-terminal de PilB

Singularisé à côté des deux autres séquences fonctionnelles MsrA et MsrB, le domaine N-terminal de la protéine PilB (NterPilB) possède un segment WCPLC correspondant à un centre disulfure rédox de type Trx avec un potentiel de -0,230 V. Il a été montré que NterPilB est capable de recycler l’activité réductase des domaines Msr isolés de PilB (Wu et al., 2005) avec cependant une meilleure efficacité pour le domaine MsrB. Le mécanisme catalytique entre une Msr et NterPilB est identique à celui qui se met en place entre une Msr et Trx.

La structure de NterPilB de Neisseriameningitidis a été résolue par RX et a montré un repliement de type Trx et plus particulièrement de type DsbE avec une boucle additionnelle FLHE (Ranaivoson et al., 2006) (Figure 20). Cette boucle, bien stabilisée par des liaisons hydrogène, est supposée importante vis-à-vis de la spécificité de substrat. En effet, il a été montré que NterPilB était capable de réduire efficacement le domaine MsrB oxydé de PilB alors que DsbE (plus proche homologue structural dont la topologie globale diverge essentiellement par l’absence de la boucle FLHE) ne le pouvait pas. Il reste toutefois des éléments à apporter pour répondre à la question du rôle de cette boucle vis-à-vis des partenaires de NterPilB.

Des études récentes in vitro ont aussi montré que NterPilB de N. gonorrhoeae était réduit par le domaine nDsbD d’E. coli (Brot et al., 2006). Les séquences de NterPilB de N. meningitidis et de N. gonorrhoeae présentent un très fort taux de similarité puisque seuls 6 résidus (éloignés du site actif) sont différents. Les structures RX de ces deux protéines sont ainsi extrêmement proches.

Figure 20 : Structures RX des domaines N-terminaux de PilB de Neisseria meningitidis et de Neisseria gonorrhoeae. Les extensions représentées en rouge sont spécifiques du repliement DsbE. La boucle FLHE supplémentaire du domaine NterPilB est indiquée entre parenthèses. Les numéros d’accès PDB sont les suivants : 2fy6 et 2h30.

Le mécanisme supposé pour la protéine PilB est le suivant : les protéines contenant des résidus MetSO sont pris en charge de façon stéréoselective par les domaines Msr A ou B réduits de PilB. Ces domaines cèdent leurs électrons à MetSO qui recouvre son état réduit Met. Ce processus engendre la

formation d’un pont disulfure intramoléculaire au sein de l’un des domaines Msr A ou B. Ce pont disulfure sera réduit par le domaine N-terminal de PilB sous forme réduite. A ce stade, demeurent quelques interrogations quant à la nature intra- ou inter-moléculaire de la réparation. En effet, l’intervention d’une deuxième protéine PilB est envisageable. Chacune des Msr recouvre, quoiqu’il en soit, sa propre activité réductrice et le domaine NterPilB oxydé reçoit des électrons provenant de nDsbD.