Fragrâncias são misturas com um alto nível de complexidade, pois sua formulação pode conter uma ampla faixa de concentração de seus componentes podendo iniciar ao nível de traços até quantidades superiores 30 %, sendo que isso naturalmente depende do comportamento olfativo da substância na mistura e suas propriedades físico-químicas e moleculares.
Baseado nessa variabilidade química, a espectroscopia Raman foi utilizada para monitorar a produção de várias amostras de fragrâncias, pois é uma técnica que consegue discriminar lotes com diferentes misturas e reproduzir resultados para as mesmas composições. Essa característica analítica é fundamental para análise de fragrâncias, pois quando ela é criada, a qualidade e
proporção dos compostos de sua composição devem ser mantidas e reproduzidas para os demais lotes, porque tal formulação é estabelecida como padrão [35].
As fragrâncias apresentam espectros Raman característicos de acordo com sua composição molecular, semelhante aos óleos essenciais. No entanto, é importante ressaltar que uma única fragrância pode conter uma mistura de diferentes óleos essenciais que resulta em uma maior complexidade analítica. A Figura 5 apresenta alguns exemplos de espectros de fragrâncias com diferentes características olfativas.
Ao tentar identificar as bandas nos espectros observa-se que algumas delas não são bem definidas como a que está localizada na região de 1455 cm-1, referente à vibração δCH2, devido à sobreposição de variadas ligações CH2
provenientes de diferentes moléculas que compõem a mistura. As bandas mais intensas localizadas em 1674 e 1624 cm-1 aparecem devido ao estiramento da dupla ligação γC=CH e γC=CH2, a banda encontrada na região de 1730 cm-1 corresponde ao
estiramento γCO. A banda em 1598 cm-1 pode estar relacionada ao estiramento do
anel, e as bandas ao redor 1032 e 1004 cm-1 são correspondentes aos benzenos monossubstituídos [97]. Como essas interações são comuns em moléculas odorantes, há uma relativa semelhança entre as principais bandas dos espectros, mesmo com diferente assinatura sensorial, no entanto, existe uma variação na proporção da intensidade dessas bandas.
Figura 5: Exemplo de espectros obtidos de algumas fragrâncias analisadas com sua respectiva descrição olfativa: Agrestic, Fern-like, Ambery; Floral, Woody; Fern-like, Aromatic, Wood e Agrestic, Chypre Like. O segundo espectro (b) mostra a ampliação do primeiro (a) na região de maior diferença espectral - 200 a 1800 cm-1.
(a)
Desenvolvimento do modelo SIMCA baseado em 20 classes
O SIMCA é provavelmente o método de classificação supervisionado mais utilizado [100]. Esse método de reconhecimento de padrão descreve q diferentes classes de amostras baseado em regras de classificação definidas pelos valores de
m medidas originadas por um grupo de n amostras conhecidas de diferentes
classes.
Regras baseadas em modelos desenvolvidos por Análise de Componentes Principais para cada classe são usadas para classificar amostras externas (amostras de previsão) com base nas mesmas medidas m, apresentadas para as novas amostras. O número de amostras classificadas corretamente pelo modelo é um parâmetro da qualidade do método empregado. Uma vez que estabelece-se que o modelo é apropriado, ele pode ser usado para classificação de amostras desconhecidas de acordo com os mesmos critérios pré-definidos [101].
Para executar o modelo de classificação foram coletados 125 espectros Raman de diferentes amostras, correspondendo a 20 tipos ou classes de fragrâncias, aprovadas no período de Janeiro de 2009 a Outubro de 2010 pelo departamento de controle de qualidade considerando seus aspectos sensoriais, físico-químicos e cromatográficos de acordo com a listagem da Tabela 2. As outras 30 amostras, sendo que 06 não pertencem a nenhuma das classes originais do modelo, formaram o conjunto de previsão.
Tabela 2: Descrição olfativa das amostras utilizadas como conjunto de treinamento do modelo de classificação obedecendo a sua sequência de fabricação.
Número
amostra Descrição olfativa*
Número
amostra Descrição olfativa
Número
amostra Descrição olfativa
1** AG FL MU 52 FL FR MU 105 FE FL FR 2 GR FR FL 53 AM FL MU 107 FL WO 3 GR FL MU 55 AG CH 108 FL AL FR 4 AG FE AM 56 FE FL FR 109 CI AR 7 CI WO MU 57 FR FL MU 110 FR FL 8 AG FE AM 58 GR FR FL 111 FL WO 9 FL GR FR 59 FR GR 112 FR GR 10 CI WO MU 60 FL WO 113 FE FL FR 12 AG CH 62 AG FL MU 114 FL AL FR 13 WO AG SP 63 FL FR MU 115 FL AL FR 14 GR FR FL 64 GR FL MU 116 FE AR CI 16 AG CH 65 FL FR MU 117 WO AG SP 17 FE AR CI 66 FR FL MU 118 AG FL MU 19 WO AG SP 67 FL WO 119 GR FL MU 20 CI AR 68 FE FL FR 121 FL GR FR 21 AG FL MU 69 FR GR 122 FL FR MU 22 FR FL MU 70 AM FL MU 123 CI AR 23 WO AG SP 71 FL FR MU 124 FR FL 24 FE AR WO 72 AG FE AM 128 FR GR 25 AG FE AM 73 CI WO MU 129 FL AL FR 26 AG CH 74 FR FL 131 AG CH 28 FR FL MU 75 FL AL FR 132 FE AR CI 29 FE AR WO 77 CI AR 133 CI AR 31 GR FR FL 79 FL WO 134 FR FL MU 33 FE AR CI 80 FR GR 136 CI WO MU 34 FE AR WO 81 FL GR FR 137 CI WO MU 35 FE AR WO 82 AG FE AM 138 CI WO MU 36 FE AR WO 83 FR FL 139 CI WO MU 37 FR GR 84 FL WO 140 AM FL MU 38 AG FE AM 85 FE FL FR 141 FE FL FR 39 CI WO MU 86 AG CH 142 CI WO MU 40 CI AR 87 FL AL FR 143 CI WO MU 41 FE FL FR 88 FR FL 144 CI WO MU 42 CI WO MU 90 AM FL MU 145 GR FL MU 44 GR FL MU 92 CI AR 146 FL FR MU 45 GR FR FL 93 GR FR FL 147 FL GR FR 46 AG FL MU 97 FL GR FR 148 FL WO 47 GR FR FL 99 FR FL 150 FE AR WO 48 CI AR 100 FE AR CI 151 FR FL MU 49 FE AR CI 101 FR FL 153 AM FL MU 50 AM FL MU 102 WO AG SP 154 CI WO MU 51 AM FL MU 103 AG FL MU *
AG, Agrestic; AL, Aldehidic; AM, Ambery; AR, Aromatic; CH, Chypre; CI, Citrus like; FE, Fern-like; FL, Floral; FR, Like Fruit; MU, Musky; GR, Green; SP, Spicy; WO, Woody.
Os espectros adquiridos para o conjunto de treinamento foram inicialmente sobrepostos para uma avaliação geral dos dados conforme projetado no gráfico da Figura 6. Nesse gráfico foi possível identificar uma região que apresenta maiores diferenciações entre os espectros de acordo com a fragrância e poderia ser considerada como uma impressão digital, portanto essas variáveis foram escolhidas para construção do modelo.
Figura 6: Sobreposição dos espectros das 125 amostras utilizadas para elaboração do modelo sem pré-processamento dos dados (a) e no gráfico em destaque espectros após processamento da primeira derivada (b). As variáveis sob a área cinza foram desconsideradas.
As 573 variáveis independentes selecionadas na região entre 616 a 1760 cm-1 foram centradas na média, ou seja, cada elemento de uma variável foi subtraída pela a média da respectiva variável e processada a sua primeira derivada pelo uso do algoritmo Savitzky-Golay com uma janela móvel de 5 pontos para suavização do ruído melhorando assim a razão sinal / ruído e proporcionando a correção da linha de base conforme Figura 6 (b). Para aplicação do método SIMCA, cada classe do conjunto de treinamento precisa ser submetida a uma análise de componentes principais (PCA), e para isso é necessário estabelecer o número de componentes principais ideal para definir cada classe [102]. Após a avaliação de
cada agrupamento do conjunto de treinamento o número total de componentes principais para cada classe variou entre 1 e 3.
Definido o número ótimo de componentes principais, o modelo foi gerado delimitando os espaços envolvendo as amostras de cada classe, cujos limites das mesmas foram definidos com 95 % de confiança. Observando a Figura 7 dos escores projetados na PC1xPC2xPC3, verifica-se que as classes estão bem modeladas, pois as fronteiras estão bem definidas com o número máximo de 3 componentes principais.
Figura 7: Projeções dos escores nas três primeiras componentes principais das 20 classes de fragrâncias. Variâncias determinadas em cada PC: PC1 = 88,23%; PC2 = 5,25% e PC3 = 1,55%
Conceitualmente é possível melhorar o modelo de classificação eliminando as variáveis de acordo com o poder de discriminação, no entanto, considera-se como um bom procedimento avaliar em conjunto o poder de discriminação e de modelagem para não haver distorções significativas nos resultados. Os resultados obtidos podem ser verificados através dos dados representados nos gráficos da Figura 8.
Normalmente é recomendada a remoção das variáveis que apresentam baixo poder de modelagem e de discriminação. As variáveis escolhidas inicialmente
não foram alteradas, pois embora exista um maior poder de discriminação entre as variáveis 1632, 1618, 1600 e 1594 cm-1 devido à vibração da dupla ligação γC=C e com menor intensidade para as variáveis 1008, 1004 e 998 cm-1 correspondente a banda de vibração do C-C o poder de modelagem total de todas as variáveis foi considerado significativo.
Figura 8: Gráfico (a) poder discriminatório de cada variável utilizada no modelo e o gráfico (b) poder de modelagem total calculado para a variável correspondente.
O modelo SIMCA proposto foi então aplicado para as 30 amostras de lotes de fragrâncias do conjunto de previsão, sendo que 06 amostras não foram contempladas em nenhuma das classes utilizadas inicialmente para elaboração do modelo, conforme destacado na Tabela 3.
Tabela 3: Conjunto de amostras para validação e, em negrito, classe de fragrâncias não utilizada na construção do modelo.
Número
amostra Descrição olfativa*
Número
amostra Descrição olfativa
Número
amostra Descrição olfativa
5 GR FR FL 61 AM FL MU 106 FE AR WO 6 WO AG SP 76 FE AR CI 120 AG CH 11** AG CH AM 78 GR FL MU 125 AG FE AM 15** AG CH AM 89 FR GR 126 FL GR FR 18 FE AR WO 91** AG CH AM 127 FE FL FR 27** AG CH AM 94 FL WO 130** AG CH AM 30 WO AG SP 95 GR FL MU 135 FR FL MU 32 CI AR 96 CI WO MU 149 FL AL FR 43 AG CH 98 FL FR MU 152 CI WO MU 54** AG CH AM 104 FR FL 155 AG FL MU
*AG, Agrestic; AL, Aldehidic; AM, Ambery; AR, Aromatic; CH, Chypre; CI, Citrus like; FE, Fern-like; FL, Floral; FR, Like Fruit; MU, Musky; GR, Green; SP, Spicy; WO, Woody.
**Amostras com classe não modelada
Como resultado da aplicação do modelo nas amostras de validação, as 24 amostras foram claramente separadas conforme as classes pré-definidas. As 06 amostras restantes não foram classificas em nenhuma classe, portanto, foram caracterizadas como não sendo do grupo de fragrâncias analisadas. Esse resultado evidencia que o modelo consegue discriminar fragrâncias diferentes, ou seja, o método permite identificar se a amostra analisada faz parte ou não do grupo previamente conhecido o que pode prevenir o seu uso inadequado. Tal constatação foi exemplificada pela área da elipse calculada no gráfico de escores da Figura 9 para cada classe. A relação detalhada do resultado da classe prevista para cada amostra pode ser examinada na Tabela 4 onde a representação “0” significa não pertencente a nenhuma classe.
Figura 9: Gráfico da projeção dos escores em 3D com os limites definidos pelas elipses baseadas no desvio padrão dos escores na direção de cada PC para todas as 20 classes modeladas. Em destaque delimitado pela elipse as amostras das fragrâncias não reconhecidas pelo modelo.
Tabela 4: Resultado da previsão das classes do conjunto de amostras para validação.
Número
amostra Classe original Classe prevista
Número
amostra Classe original Classe prevista
5 GR FR FL GR FR FL 94 FL WO FL WO 6 WO AG SP WO AG SP 95 GR FL MU GR FL MU 11 AG CH AM 0 96 CI WO MU CI WO MU 15 AG CH AM 0 98 FL FR MU FL FR MU 18 FE AR WO FE AR WO 104 FR FL FR FL 27 AG CH AM 0 106 FE AR WO FE AR WO 30 WO AG SP WO AG SP 120 AG CH AG CH 32 CI AR CI AR 125 AG FE AM AG FE AM 43 AG CH AG CH 126 FL GR FR FL GR FR 54 AG CH AM 0 127 FE FL FR FE FL FR 61 AM FL MU AM FL MU 130 AG CH AM 0 76 FE AR CI FE AR CI 135 FR FL MU FR FL MU 78 GR FL MU GR FL MU 149 FL AL FR FL AL FR 89 FR GR FR GR 152 CI WO MU CI WO MU 91 AG CH AM 0 155 AG FL MU AG FL MU
AG, Agrestic; AL, Aldehidic; AM, Ambery; AR, Aromatic; CH, Chypre; CI, Citrus like; FE, Fern-like; FL, Floral; FR, Like Fruit; MU, Musky; GR, Green; SP, Spicy; WO, Woody.
Desenvolvimento do modelo SIMCA baseado em 5 classes
Apesar do grande número de amostras consideradas no modelo de classificação elaborado anteriormente, o número de amostras de previsão para cada classe pode ser considerado pequeno, com poucas amostras para algumas classes. Por esse motivo um novo conjunto de amostras foi separado para obtenção dos seus espectros. Os parâmetros para análise foram os mesmos adotados na construção do modelo anterior.
É importante considerar que a produção de lotes de fragrâncias no período de estudo, Janeiro de 2009 a Julho de 2011, foram fabricados para atender pedidos de clientes, portanto o número de lotes das fragrâncias foi limitado a esse contexto. Como normalmente um lote de maior volume é produzido e fracionado em várias etapas de entrega, essa segunda etapa do estudo contou com o número máximo 18 amostras (lotes) de uma mesma fragrância.
Dentre as classes iniciais foram escolhidas as com maior número de amostras produzidas no período. O total de classes com número adequado para elaboração e validação do modelo foram 5, que corresponde a 48 amostras de calibração e 25 amostras de validação.
Adotando uma proporção relativamente maior de amostras para criação do modelo de classificação com uma quantidade de classes mais restrita, é evidente a separação dos grupos de amostras de acordo com sua característica olfativa. Essa discriminação é facilmente observada nos gráficos originados na elaboração e previsão do modelo como pode ser avaliado na Figura 10. Todas as 25 amostras de validação foram corretamente classificadas.
A Tabela 5 a seguir demonstra resumidamente os parâmetros para geração do modelo, bem como o índice de acerto das amostras de fragrância em cada classe.
(a) (b)
Figura 10: Gráfico da projeção dos escores nas três primeiras PC’s das 05 classes de fragrâncias. (a) representa o gráfico das 48 amostras para elaboração do modelo de classificação e (b) as 25 amostras de validação.
Tabela 5: Resultado da previsão das classes validação.
Classes Previstas
FR, GR* CI, WO, MU FR, FL FE, FL, FR FL, AL, FR
FR, GR 5 0 0 0 0 CI, WO, MU 0 5 0 0 0 FR, FL 0 0 5 0 0 FE, FL, FR 0 0 0 5 0 FL, AL, FR 0 0 0 0 5 PC** 2 3 2 3 2
*Mesmos descritores presentes na Tabela 2;
**Número de Componentes Principais no modelo SIMCA.
O excelente índice de acerto comprova a qualidade do método multivariado SIMCA para discriminação e classificação de amostras de fragrâncias utilizando a Espectroscopia Raman. Tal método foi capaz de discriminar amplamente a quantidade de classes estudadas, como demonstrado no primeiro estágio do desenvolvimento do método analítico, onde foi possível classificar as 24 amostras em 20 classes e eliminado 06 amostras não pertencente a nenhuma classe inicialmente modelada, o que demonstra a seletividade do método analítico e a precisão na classificação das demais amostras do mesmo lote. Portanto trata-se de um método promissor para classificação de fragrâncias com características sensoriais distintas.