L’utilisation des inhibiteurs du protéasome dans le traitement des cellules leucémiques, et plus particulièrement des leucémies aigües myéloïdes (LAM) et leurs mécanismes d’action représentent le sujet principal de ce travail de thèse. Ainsi, ce chapitre abordera dans un premier volet l’introduction des inhibiteurs en clinique pour le traitement des cancers, puis l’importance du système ubiquitine protéasome dans les phénomènes de cancérisation des cellules. L’action principale de cette drogue étant d’induire l’apoptose des cellules cancéreuses, je reviendrai sur les mécanismes d’apoptose, puis sur les différents facteurs impliqués dans la réponse des cellules au traitement par les inhibiteurs du protéasome. Enfin le dernier paragraphe, après un bref rappel sur l’hématopoïèse, se focalisera sur les inhibiteurs du protéasome dans les traitements des LAM.
I. Les inhibiteurs du protéasome
Les inhibiteurs du protéasome ont tout d’abord été utilisés comme outils en recherche fondamentale afin d’élucider la fonction et la spécificité de dégradation des activités protéolytiques du protéasome 20S. Ces inhibiteurs ont ainsi pu contribuer à la compréhension des fonctions essentielles du protéasome 26S dans différents processus et mécanismes des cellules eucaryotes {Naujokat et al., 2007, Gaczynska, 2005 #768, Adams, 2004 #592, Naujokat, 2007 #770, Dalton, 2004 #772, Groll, 2004 #771}. Bien que le protéasome possède plusieurs sites catalytiques, l'inhibition de tous les sites n'est pas nécessaire pour réduire de façon significative la dégradation protéique. De nombreuses études démontrent que seule l’inhibition de l'activité chymotrypsine-like, portée par les sous-unités β5, est suffisante pour permettre une réduction importante du taux de dégradation des protéines alors que l'inactivation des autres sites, trypsine-like et PGPH, n'a que peu d'effet sur la protéolyse totale {Kisselev & Goldberg, 2001}. De plus, la plupart des inhibiteurs de l'activité Chymotrypsine-like sont hautement hydrophobes ce qui facilite leur passage au niveau de la membrane plasmique des cellules. En conséquence, la majorité des inhibiteurs utilisés actuellement agissent principalement sur l'activité chymotrypsine-like mais possèdent également quelques effets sur les deux autres types d’activités (typsine- Like et PGPH).
I.A. Les principaux inhibiteurs du protéasome
Les inhibiteurs du protéasome sont classés en fonction de leur origine (naturelle ou synthétique) et de leur groupement pharmacophore (Figure 11). Ce sont des dérivées
40
peptidiques (sauf la lactacystine) dont le groupement pharmacophore, qui est généralement localisé en C-terminal, interagit avec les thréonines N-terminales des sites catalytiques du protéasome 20S en se fixant de façon réversible ou irréversible {Kisselev & Goldberg, 2001}. Les inhibiteurs synthétiques sont principalement représentés par la famille des peptides aldéhydiques et vinylsulfones. Les peptides aldéhydiques sont les premiers inhibiteurs du protéasome qui ont été développés. Cette classe d’inhibiteur est représentée par les molécules suivantes : l'Ac-Leu-Leu-nLeu-al (ALLN), Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al ou PSI, le tripeptide aldéhyde Z-Leu-Leu-Leu-al ou MG132 et le dipeptide aldéhyde CEP-1612 {Kisselev & Goldberg, 2001}. La famille des peptides vinylsulfones est représentée par deux composés majeurs : le NVLS et le peptide Tyr-Leu-Leu-Leu-vinylsulfone (YL3VS) {Glas et al., 1998}. On retrouve également la famille des peptides boronates qui sera décrite dans le paragraphe suivant. Les molécules d’origine naturelle inhibant l’activité du protéasome sont la lactacystine, un métabolite issu de Streptomyces {Fenteany et al., 1995}, et les époxycétones. Les principales époxycétones utilisées actuellement sont l’époxomycine, l'éponémycine et le peptide cyclique TMC-95 {Kisselev & Goldberg, 2001}.
Figure 11 : Principales classes d’inhibiteurs du protéasome
Les différentes familles d’inhibiteurs du protéasome. En rouge: le groupement pharmacophore.
Adapté d’après Kisselev, A. F. & Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors : from research tools to drug candidates. Chem Biol (2001).
Les peptides aldéhydiques Les peptides Vinylsulfones La Lactacystine et ses dérivées
Les peptides Epoxycétones
Les peptides Boronates
41
I.B. Spécificité des inhibiteurs
Tous ces composés se lient au sous-unités catalytiques du protéasome 20S et inhibent ainsi ces activités protéolytiques {Kisselev & Goldberg, 2001}. Plusieurs de ces inhibiteurs sont peu spécifiques du protéasome ou présentent une cinétique intracellulaire peu favorable ne permettant pas leur utilisation en thérapeutique. Par exemple, les inhibiteurs de la famille des peptides aldéhydiques, qui sont réversibles et possèdent une vitesse de fixation lente sur les sites portant l’activité Chymotrypsine- Like, ont des taux de dissociation élevés et sont rapidement oxydés en acides inactifs et transportés hors de la cellule par le système « multidrug resistant » (MDR), qui est un des mécanismes de résistance des cellules aux agents cytotoxiques {Kisselev & Goldberg, 2001}. Les effets de ces inhibiteurs sont donc rapidement annulés sur des modèles cellulaires. De plus, ces composés inhibent également l’activité des protéases à sérine et cystéine, comme les calpaïnes et les cathepsines, ils ne sont pas utilisables sur les patients. Néanmoins, ces composés, et notamment le MG132, restent à l’heure actuelle des inhibiteurs de choix comme outils de recherche pour les expériences impliquant des cultures cellulaires ou de tissus. Les peptides vinylsulfones et les inhibiteurs naturels du protéasome, comme la lactacystine, présentent une plus grande spécificité pour le protéasome comparés aux peptides aldéhydiques mais modifient de façon covalente les sous- unités catalytiques β5 du protéasome. Ils conduisent ainsi à une inhibition permanente du protéasome {Bogyo et al., 1997, Kisselev, 2001 #638} préjudiciable pour leur utilisation en clinique {Richardson et al., 2003}. Le remplacement du groupement aldéhydique des peptides par un acide boronique permet d’améliorer leur sélectivité pour le protéasome et de pallier aux problèmes évoqués précédemment. En effet, comme pour les aldéhydes, les peptides boronates agissent en formant un adduit tétraédrique avec la thréonine du site actif. Toutefois, ces peptides différent de leurs analogues aldéhydiques par leur vitesse de dissociation avec le protéasome qui est plus lente, permettant ainsi une inhibition stable. Par ailleurs, les boronates sont beaucoup plus sélectifs que les aldéhydes puisqu'ils inhibent très peu les thiol-protéases. De plus, ces inhibiteurs ne sont pas inactivés par oxydation et ne sont pas sécrétés rapidement par le système MDR. Enfin, des travaux démontrent que les peptides boronates sont 100 fois plus actifs que leur analogues aldéhydiques {Kisselev & Goldberg, 2001}. Cette combinaison de capacité inhibitrice, de sélectivité et de stabilité métabolique fait des peptides boronates les meilleurs candidats pour la thérapie anti-cancéreuse par rapport aux autres classes d'inhibiteurs {Richardson et al., 2003}. Le PS-341 ou Bortézomib, un dipeptide boronate, est d'ailleurs le premier inhibiteur du protéasome ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché (AMM) par la FDA US en 2003 pour le traitement de patients atteints de myélomes
42
multiple récidivants. Il est actuellement commercialisé par la société Millenium Pharmaceuticals sous le nom de Velcade™.
I.C. Le Bortézomib ou PS-341 : nouvelle drogue antitumorale
Le PS-341 ou Bortézomib (Figure 11), est un dipeptide boronate capable de fixer spécifiquement le protéasome et d’inhiber de façon réversible son activité Chymotypsine-like. Il inhibe le protéasome en interagissant avec les résidus thréonines situés au niveau des sites catalytiques, mais avec une affinité décroissante pour le site de β5, β1 et β2, respectivement {Berkers et al., 2005}. En effet, même utilisé à des fortes concentrations (10 µM), il n’exerce aucune inhibition sur une large variété de récepteurs et de protéases sélectionnés. Il serait plus de 1 500 fois plus sélectif pour le protéasome que pour l’enzyme présentant l’affinité la plus proche. De plus, des études réalisées in vitro montrent que le Bortézomib se dissocierait lentement du protéasome (t1/2 de 20 minutes) et permettrait d’obtenir une inhibition stable. Il
présente également l’avantage d’être efficace à de faibles doses pharmacologiques. En effet, une faible concentration en Bortézomib (7 nM) est capable de réduire de 50 % la prolifération tumorale. Des travaux montrent également que l’injection directe de Bortézomib sur des tumeurs humaines implantées dans des souris conduit dans 40 % des cas à une réduction de plus de 70 % du volume de la masse tumorale {Adams et al., 1999}. Il a donc démontré une activité antitumorale significative et une toxicité tolérable utilisé seul ou en combinaison avec d'autres agents anticancéreux lors des essais pré-cliniques et cliniques. De plus, les cellules cancéreuses seraient plus sensibles aux effets pro-apoptotiques de l’inhibition du protéasome que les cellules normales {Adams, 2004}. Initialement mis sur le marché pour le traitement des myélomes multiples, de nombreux essais cliniques réalisés actuellement évaluent l’utilisation de cette nouvelle classe de molécule seule ou en combinaison pour le traitement d’autres formes de cancers {Almond & Cohen, 2002}. Ces considérations seront développées ultérieurement.
I.D. Nouvelle génération d’inhibiteur du protéasome
Avec la validation du protéasome comme cible pour la thérapie de cancers, de nombreux travaux se sont intéressés à la découverte d’autres inhibiteurs utilisables en clinique. Ces travaux ont conduit à la découverte de deux nouveaux agents de seconde génération qui ont été validés lors d’études cliniques en phase I : le NPI-0052 (salinosporamide A, β-lactone) et le carfilzomib (PR-171, dérivé de l’époxomicine). A la différence du Bortézomib, qui se lie lentement et de façon réversible au protéasome, NPI- 0052 et le carfilzomib se lient irréversiblement, empêchant de rétablir une activité
43
protéasomale. Ces deux inhibiteurs induisent une dépolarisation du potentiel membranaire mitochondrial et activent l’apoptose médiée par la de caspase-8. Le carfilzomib active également la caspase-9. Les études précliniques ont démontré que ces deux inhibiteurs permettaient de lever, au moins partiellement, la résistance du Bortézomib in vitro {Kuhn et
al., 2007}. D'ailleurs, ces inhibiteurs ont montré une activité anticancéreuse plus importante
comparé au Bortézomib dans un grand nombre de modèles cellulaires, y compris dans les myélomes multiples {Kuhn et al., 2007} et la leucémie lymphocytaire chronique {Ruiz et al., 2006}, suggérant qu’ils possèdent un plus large spectre d'activité. Les premiers résultats des études cliniques de phase I en utilisant le carfilzomib indiquent qu’il est bien toléré, même utilisé à forte dose, et présente une neurotoxicité plus faible que le Bortézomib {Voorhees & Orlowski, 2007}. L'évidence de leur activité antitumorale à été démontrée sur les myélomes multiples, incluant dans les patients atteints de myélomes réfractaires au traitement par le Bortézomib. Des études cliniques de phase II sont prévues. Une autre cible intéressante pourrait être l'immunoprotéasome {Rivett & Hearn, 2004}, dont l'expression peut être restreinte à certains tissus en comparaison avec le protéasome standard. Tous les inhibiteurs actuellement disponibles ciblent les isoformes standards et l’immunoprotéasome, mais l'identification d’inhibiteurs spécifiques de l’immunoprotéasome apporterait des améliorations dans l’utilisation de ces drogues. De plus, comme l'immunoprotéasome est exprimé principalement dans les tissus hématopoïétiques, il est possible que de tels agents puissent agir en limitant les effets neurotoxiques ou gastro-intestinaux, car ces tissus expriment très peu de sous-unités de l’immunoprotéasome. Ces nouvelles générations d’inhibiteurs du protéasome entrent actuellement en clinique et peuvent représenter une option efficace pour les patients qui ne tolèrent pas le Bortezomib ou dont la maladie est réfractaire au traitement par cette drogue. En conclusion, il faut souligner que les premiers tests cliniques évaluant le potentiel thérapeutique des inhibiteurs du protéasome ont commencé il y a près de 10 ans, et depuis lors, des progrès remarquables ont pu être réalisés.
II. Apoptose et cancer
La mort cellulaire programmée ou apoptose constitue le processus principal de mort cellulaire. Elle joue un rôle majeur au cours du développement embryonnaire, de la croissance, ainsi que chez l'adulte où elle est essentielle pour le maintien de l’homéostasie cellulaire. Ainsi, une dérégulation des mécanismes contrôlant l’apoptose peut participer au développement de pathologies, notamment les maladies autoimmunes, les maladies neurodégénératives (maladie d’Alzheimer), les déficits immunitaires (HIV) et les cancers.
44
C’est le cas des leucémies lymphocytiques chroniques à cellules B (B-CLL) qui sont caractérisées par une accumulation de cellules quiescentes tumorales.
II.A. Caractéristiques morphologiques et biochimiques de
l’apoptose
L’apoptose est définie par des modifications morphologiques caractéristiques observables au niveau du noyau et de la membrane plasmique. Une condensation et une fragmentation de la chromatine nucléaire ainsi qu’une réduction du volume cellulaire sont d’abord observées. Par la suite, le noyau se fragmente et des évaginations (blebbing) se forment au niveau de la membrane plasmique, ces dernières formeront plus tardivement les corps apoptotiques. Des modifications biochimiques typiques interviennent également au cours de l’apoptose : la fragmentation internucléosomale de l’ADN, un dysfonctionnement mitochondrial et l’externalisation des phosphatidylsérines (PS) à la surface cellulaire. Ce dernier phénomène semble participer à la reconnaissance et à la phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages. L’intégrité de la membrane plasmique étant maintenue jusqu’à l’élimination des corps apoptotiques, la réaction d’inflammation est limitée. Enfin, l’activation de protéases de la famille des Caspases (Cystéinyl aspartate specific proteinase) constitue une véritable signature de l’apoptose (Figure 12).
Figure12 : Les différentes classes de caspases.
Adapté d’après Fuentes-Prior, P.et al.. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J.2004
Les caspases peuvent être subdivisées en trois grands groupes selon leur site spécifique de reconnaissance du substrat, selon leur structure ou selon leur fonction
45
biologique : le premier groupe comprend les caspases-1, -4 et -5 qui jouent un rôle dans les réponses inflammatoires en participant à l’activation protéolytique de cytokines proinflammatoires. Ces caspases ne jouent pas de rôle important dans l’apoptose {Fuentes- Prior & Salvesen, 2004}. Les deux autres groupes sont constitués des caspases qui jouent un rôle majeur dans l’apoptose : les caspases initiatrices qui sont activées directement en réponse au stimulus apoptotique et les caspases effectrices qui sont activées par les caspases initiatrices. Les caspases initiatrices contiennent des domaines d’interaction nécessaires à leur recrutement dans des complexes d’activation : DED pour death effector domain et CARD pour caspase recruitment domain. Cette famille de protéine clive des protéines structurales de la cellule et inactive des protéines essentielles à la survie et sont responsables de la plupart des caractéristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose.
II.B. La machinerie apoptotique
Il existe deux voies majeures d’induction de l’apoptose : la voie extrinsèque, impliquant des récepteurs appartenant à la superfamille des récepteurs de la mort cellulaire, dont le principal représentant est le TNF, et la voie intrinsèque mettant particulièrement en jeu la mitochondrie. Ces deux voies de signalisation conduisent à deux phénomènes centraux dans l’apoptose qui sont l’activation de la cascade des Caspases et la perméabilisation de la membrane mitochondriale {Chipuk et al., 2005}. Les caspases ainsi activées clivent les protéines structurales de la cellule et inactivent des protéines essentielles à la survie {D'Amelio et al., 2008}.
II.B.1
La voie extrinsèque
La voie extrinsèque (Figure 13) est initiée au niveau de la membrane plasmique par l’activation de récepteurs de mort, membres de la superfamille du TNF-R (Tumor Necrosis Factor Receptor) tels que le TNF récepteur-1 (TNFR-1), Fas (CD95 ou APO-1) et TRAIL (TNFrelated apoptosis inducing ligand) récepteur, appelé aussi DR4 et DR5 pour « Death Receptor » {Smith et al., 1994}. Présents à la surface cellulaire sous forme de trimères pré- associés, la fixation de leurs ligands respectifs, le TNFα, FasL (CD95-L) et TRAIL (Apo2L), entraîne l’agrégation des récepteurs et leur activation permettant le recrutement de protéines adaptatrices au niveau du domaine de la mort « Death Domain, DD ». Ainsi, dans la signalisation de Fas, la protéine FADD (Fas-Associated Death Domain protein) est recrutée au niveau du récepteur par son domaine DD et permet à son tour le recrutement des caspases- 8 et -10 par le domaine DED présents à la fois sur FADD et sur les caspases initiatrices. Un
46
Voie intrinséque Voie extrinséque
complexe multimoléculaire appelé DISC (Death Inducing Signaling Complex) est alors formé. De par leur proximité ces caspases se dimérisent et cette dimérisation semble suffisante pour rendre les caspases actives et permettre leur maturation par protéolyse. La cascade des caspases indépendamment de la mitochondrie est ainsi activée.
II.B.2
La voie intrinsèque
La voie intrinsèque (Figure 13) implique la mitochondrie et est activée par divers agents de stress tels que la privation en sérum, les radiations ionisantes, les dommages à l’ADN, les agents chimiothérapeutiques, les infections virales ou bactériennes. Elle permet notamment l’activation de protéines membres de la famille de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) qui participent à la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (MOMP : Mitochondrial outermembrane permeabilization) et au relargage de facteurs mitochondriaux solubles (cytochrome c) impliqués dans la signalisation apoptotique {Kroemer, 2005 #812}. Le cytochrome c libéré dans le cytosol s’associe avec Apaf-1 (Apoptotic Protease- activating factor), la protéine qui permet le recrutement ATP-dépendant de la pro-caspase-9 par l’intermédiaire des domaines CARD présents à la fois sur la caspase-9 et sur Apaf-1. Le complexe ainsi formé est appelé « apoptosome » et permet l’activation de la caspase-9.
Figure 13 : Les voies de signalisation intrinsèque et extrinsèque de l’apoptose conduisant à l’activation des caspases effectrices.
D’après Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Kuwana, T., Newmeyer, D. D. & Green, D. R. PUMA couples the nuclear and cytoplasmic proapoptotic function of p53. Science 309, 1732-5 (2005).
47
III. Effet antitumoral de l’inhibition du protéasome
L'inhibition pharmacologique du protéasome induit in vitro la mort par apoptose de cellules tumorales, tels que les cellules de lignées leucémiques U937 {Imajoh-Ohmi et al., 1995}, les cellules de leucémie lymphoïdes chroniques (LLC) devenues résistantes aux chimiothérapies et aux radiations {Delic et al., 1998}, ainsi que des modèles de lymphomes non hodgkiniens {Orlowski et al., 1998}. Bien que le protéasome soit nécessaire à la survie de toute cellule, les effets apoptotiques des inhibiteurs du protéasome s’avèrent être plus importants sur des cellules transformées, prolifératives en comparaison à des cellules normales et quiescentes {Almond & Cohen, 2002}. L'activité accrue du protéasome dans les cellules tumorales semble en particulier participer à la résistance à l'apoptose, cette caractéristique est commune à la plupart des tumeurs malignes {Rajkumar et al., 2005}. Les mécanismes de l'hyperactivité du protéasome dans les tumeurs malignes ne sont pas parfaitement élucidés mais pourraient impliquer la surexpression de certaines de ses sous- unités enzymatiques et d'enzymes responsables de l'ubiquitinylation. Il n'a cependant pas été mis en évidence de mutations spécifiques en niveau des gènes du protéasome. Le protéasome est capable de dégrader un très grand nombre de protéines. Une augmentation de son activité dans les lignées tumorales peut ainsi conduire à une diminution de la concentration de protéines nécessaires à l'apoptose et à l'arrêt du cycle cellulaire. Il existe cependant des exceptions à cette généralisation car les inhibiteurs du protéasome induisent efficacement l'apoptose des cellules de leucémies lymphocytaires chroniques B (B-CLL), qui sont principalement quiescentes {Masdehors et al., 2000}. Les inhibiteurs du protéasome sont capables d’induire l'apoptose dans de nombreux types de cellules cancéreuses devenues résistantes aux autres drogues antitumorales classiques ainsi que dans des cellules leucémiques primaires de patients atteints de leucémies lymphocytaires chroniques B (B- CLL). Les études précliniques réalisées par l'institut national du Cancer (NCI), en utilisant le Bortézomib démontrent qu’il serait cytotoxique sur plus de 60 types de lignées cellulaires, et de façon intéressante, il semblerait que son mécanisme de cytotoxicité diffère des 60000 autres composés de la banque de données du NCI {Almond & Cohen, 2002}. Ces résultats démontrent clairement le potentiel des inhibiteurs du protéasome en tant qu'agents anticancéreux. Enfin, de nombreuses études réalisées sur des modèles précliniques permettent aujourd’hui d’argumenter sur l’efficacité des inhibiteurs du protéasome dans la chimiosensibilisation de cellules devenues résistantes, avec des effets plus importants lors d’utilisation en synergie avec d’autres agents antitumoraux {Hideshima et al., 2001} {Hideshima, 2002 #802} {Ma et al., 2003} {Mitsiades et al., 2002}.
48
Bien que l’efficacité des inhibiteurs du protéasome soit actuellement clairement démontrée, les mécanismes d’action précis permettant d’expliquer leur l’activité antitumorale ne sont pas encore entièrement élucidés. Toutefois, l’ensemble de données existantes laissent supposer qu’ils seraient différents en fonction du type cellulaire et impliquent différents facteurs biologiques. Ainsi, nous discuterons dans ce paragraphe des principaux facteurs décrits dans la littérature qui pourraient être impliqués dans les mécanismes d’action de cette nouvelle classe de drogue antitumorale.
III.A. La voie NF-κB
L’une des première voies décrites pour être affectée par l’inhibition du protéasome est l’inactivation de la voie de signalisation de NF-κB (Nuclear Factor κ chain transcription in B