B Techniques de détection de l’apoptose 113

L’apoptose ou mort cellulaire programmée se déroule de manière ordonnée et régulée. Elle diffère de la mort par nécrose qui se définit par des modifications morphologiques survenant lorsqu’une cellule arrive en fin de vie à la suite d’événements tels qu’un traumatisme important comme un arrêt ou une diminution de la circulation sanguine au niveau d’un organe, l’hyperthermie, une intoxication par un produit chimique, etc… Lors de la mort d’une cellule par nécrose, c’est la membrane de la cellule qui est la plus touchée, entraînant une absence de régularisation des pressions régnant à l’intérieur de celle-ci, à l’origine la rupture de la cellule et au déversement (la cellule se vide) de son contenu dans les tissus de voisinage. La nécrose est à l’origine du processus inflammatoire.

La mort par apoptose, contrairement à la nécrose, ne provoque pas d'inflammation : les membranes plasmiques ne sont pas détruites, et la cellule émet des signaux (en particulier,

114 Induction

Activation des récepteurs

Cytochrome C/Apaf-1

Réduction du potentiel transmembranaire Activation des caspases

Exposition des phosphatidyl sérines Changements morphologiques

Fragmentation de l’ADN

Temps

Evénements précoces

Evénements tardifs

elle expose sur le feuillet externe de sa membrane plasmique de la phosphatidylsérine, un phospholipide normalement constitutif de son feuillet interne) qui permettront sa phagocytose par les globules blancs notamment les macrophages. Ce processus se divise en trois grandes phases : l’initiation, la régulation et la destruction. Ils se déroulent de façon chronologique. On distingue des événements apoptotiques « précoces » (activation des récepteurs de la mort, libération du cytochrome c, activation des caspases…) et des événements « tardifs » (exposition des phosphatidylsérines, changements morphologiques et la fragmentation de l’ADN) (Figure 37). Lors de la phase de destruction, le cytoplasme et de la chromatine des cellules se condensent, la membrane plasmique bourgeonne, puis des vésicules ou corps apoptotiques se forment et sont ensuite relargués, afin d’être phagocytés par les cellules voisines, sans aucune réaction inflammatoire.

Figure 37 : Chronologie de l’apoptose.

Evénements moléculaires précoces et tardifs caractérisant l’état apoptotique d’une cellule

Différentes techniques sont associées à la détection de ces événements apoptotiques, des plus précoces aux plus tardifs :

115

I.B.1

Détection du relargage du cytochrome c et Apaf-1 dans le

cytosol

Le cytochrome c et la protéine Apaf-1 jouent un rôle central dans l’activation de la caspase-9. Elles sont relarguées dans le cytosol par la mitochondrie et sont détectées par immunofluorescence ou immunodétection.

I.B.2

Détection de l’activation des caspases

La famille des caspases est impliquée dans la dégradation de protéines qui vont influer sur les changements morphologiques de la cellule (voir introduction). L’activation des caspases peut être visualisée, soit directement par détection de la forme active clivée de la caspase en immunodétection ou immunofluorescence, soit indirectement par la détection du clivage ou des effets liés au clivage de ses substrats.

Parmi les substrats des caspases, on retrouve :

• La Poly-(ADP-ribose) polymérase (PARP), une enzyme de réparation de l’ADN, dont un fragment de 87 kDa peut être détecté par immunodétection ou immunofluorescence suite à l’activation des caspases.

• Les lamines, qui lorsqu’elles sont clivées conduisent à un rétrécissement des noyaux et leurs bourgeonnements.

• Les protéines du cytosquelette (Fodrin, gelsolin), dont le clivage génère la perte de la morphologie de la cellule.

• La sous-unité régulatrice de PAK2 (p21-activated kinase family), dont le clivage favorise la formation des vésicules.

I.B.3

Mesure de l’altération de la membrane plasmique

La membrane plasmique des cellules est remaniée afin de faciliter l’élimination des corps apoptotiques in vivo par les macrophages. Les phosphatidylsérines localisées du côté cytosolique de la membrane sont transférées sur le feuillet externe. Ces phosphatidylsérines possèdent une forte affinité pour l’annexine-V. L’altération de l’asymétrie de la membrane plasmique peut donc être détectée en mesurant la fixation de l’annexine V par cytométrie de flux (Voir Matériels et Méthodes). Un double marquage des cellules Annexine V et iodure de propidium permet ensuite de discriminer efficacement les cellules mortes par apoptose et par nécrose. Cette approche permet la quantification rapide des cellules en apoptose. Elle présente également l’avantage de nécessiter un très faible nombre de cellules.

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I.B.4

Evaluation de l’activité endonucléasique

Elle peut être réalisée en suivant la fragmentation de l’ADN par la méthode TUNEL qui utilise la terminale déoxynucléotidyl transférase (TdT) pour transférer des nucléotides modifiés X-dUTP (avec X= biotine ; DIG, fluorescein) sur les fragments d’ADN libres. Puis ces sites marqués sont détectés par une réaction enzymatique. Les fragments ADN peuvent également être séparés par électrophorèse et visualisés par marquage. Cette technique est très sensible mais difficile à mettre en œuvre.

Il est en général admis que la caractérisation de l’apoptose nécessite l’utilisation de plusieurs approches. Dans le cadre de notre travail, nous avons choisi de combiner, d’une part, une approche détectant les changements morphologiques (Annexine V/ Iodure de Propidium, qui peut être associée à un marquage des noyaux au DAPI pour visualiser les corps apoptotiques) et permettant de discriminer apoptose et nécrose et, d’autre part, une méthode de détection biochimique (suivi du clivage de la Parp en immunodétection et immunofluorescence) très utilisée pour sa facilité de mise en oeuvre, afin d’évaluer et de quantifier la proportion de cellules en apoptose suite au traitement par des inhibiteurs du protéasome. Ces différentes approches ont été mises en place au laboratoire pour ces études. En particulier, des protocoles d’analyse des données par FACS adaptés à nos besoins ont été développés (voir Matériels et Méthodes).