Le génotypage

Le génotypage des souris consiste à caractériser les allèles ou la présence de nos différents gènes d’intérêt. Pour cela, il est nécessaire d’extraire l’ADN génomique à partir d’un fragment de tissu (doigts, queue, peau…) puis de l’amplifier par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) avec des amorces spécifiques du gène et enfin de réaliser une détection sur gel d’agarose.

La technique de PCR confère à ces analyses une sensibilité telle que des précautions strictes doivent être prises pour éviter les contaminations qui généreraient des faux positifs. Un jeu de pipettes est dédié à cet usage et toutes les pipettes sont munies de pointes à filtres. Elles sont régulièrement nettoyées par autoclavage ou traitement avec une solution ad hoc. L’ADNg est extrait sur une paillasse et avec du matériel dédié, les PCR sont assemblées sur

une paillasse distante et les tubes d’ADNg sont manipulés de sorte à éviter les contaminations par « carry over ». L’analyse des PCR par électrophorèse est menée dans une pièce distincte. Des contrôles positifs et négatifs sont systématiquement inclus dans chaque série de PCR.

2.1.1 Extraction d’ADN génomique (ADNg)

Le tissu est tout d’abord dissocié dans 100 µL d’un tampon de lyse contenant une protéase thermostable (KapaBiosystems ; Kapa Express Extract ; KK7103) pendant dix minutes à 75°C. La protéase est inactivée par une incubation de cinq minutes à 95°C. Le milieu réactionnel est mélangé puis centrifugé une minute à 15800 g afin de séparer les débris cellulaires du surnageant dans lequel se trouve l’ADNg. L’ADNg est conservé à -20°C. Chaque gène d’intérêt est caractérisé par une ou plusieurs PCR à partir d’1 µL d’ADNg (~25ng).

2.1.2 Analyse du locus Ncl

Plusieurs couples d’amorces peuvent être utilisés pour déterminer les allèles de Ncl. La Figure 9 précise la position des différentes amorces en fonction de la région analysée et les tailles attendues des fragments PCR.

Figure 9 – La stratégie de génotypage permet d’identifier les allèles du gène Ncl.

Les amorces Lf4783/Er4784 amplifient les trois types d’allèles possibles pour Ncl et permettent d’identifier la présence de la délétion. Les Lf4786/Lxr4787 sont spécifiques de la séquence loxP tandis que les autres couples d’amorces identifient les allèles sauvages et loxP.

Les amorces Lf 4783/Er 4784 permettent de déterminer si la délétion de l’exon a été réalisée. Ce couple d’amorces est utilisé systématiquement dès que l’exon 3 du gène Ncl est susceptible d’être excisé. Une autre PCR est effectuée avec les amorces Ef 4785/Er 4784. Cette PCR permet de savoir si la séquence loxP est présente ou non et de lever d’éventuelles ambiguïtés présentes dans la première PCR. Ce couple d’amorces a été choisi en raison de l’absence d’un amplicon aspécifique de 400 pb que l’on peut observer avec les amorces Lf 4788/Lr 4789 lorsque les échantillons sont hétérozygotes Ncl^+/fl. Enfin, les amorces Lf 4788/Lxr 4787 sont spécifiques de la séquence LoxP mais ne permettent pas de discriminer à elles seules si la délétion est effective.

2.1.3 Détermination de la présence des transgènes Nestin-Cre

et Nestin-Cre (FT)

Cette PCR utilise deux couples d’amorces : le couple Cre 531/Cre 819, spécifique du transgène et le couple CD8S/CD8AS utilisé comme contrôle interne. En effet, si le transgène

Nestin-Cre est présent dans les cellules, les amorces Cre 531/Cre 819 donneront un amplicon

d’une taille théorique de 288 pb détectable sur gel d’agarose à ~300 pb. En revanche, si le transgène est absent, ces amorces ne s’hybrideront pas sur l’ADNg et aucune bande ne sera détectée sur gel. Dans cette situation, on ne peut pas savoir si l’échantillon testé est

Nestin-Cre^-/- ou s’il y a eu un problème d’amplification. Pour pallier à cette indétermination, les amorces CD8S/CD8AS sont ajoutées au milieu réactionnel afin d’amplifier 100 pb de l’ADNg sur tous les échantillons à génotyper et s’assurer que la réaction de PCR s’est déroulée correctement.

2.1.4 Détermination de la présencedu transgène Rosa-CreER

La PCR de génotypage du transgène Rosa-CreER^T2 nécessite trois amorces : R26F2 et R26R, spécifiques du locus Gt(ROSA)26, et CreER qui s’hybride sur la séquence du transgène. La Figure 10 précise la position de celles-ci.

Figure 10 - Position des amorces sur le transgène Rosa-CreER^T2.

Les amorces R26F2/CreER fonctionnent en présence du transgène CreER^T2 et ne donnent pas d’amplicon s’il est absent.

Si le transgène est absent, l’amorce CreER ne sera pas utilisée et les amorces R26F2/R26R permettront l’amplification d’un fragment de 650 pb en théorie et détectable à 600 pb sur gel d’agarose. L’échantillon est alors considéré comme sauvage CreER

T2-/-.

En revanche, si le transgène est intégré dans le locus Rosa26, les amorces R26F2/CreER peuvent s’hybrider et un amplicon de 900 pb sur gel d’agarose indiquera la présence du transgène.

L’ensemble des caractéristiques des PCR des différents gènes est précisé dans l’Annexe 2.

Etant donné que la PCR Lf 4783/Er 4784 donne des amplicons de tailles différentes, elle est parfois délicate à réaliser. Aussi, le kit FastStart PCR Master de Roche (Cat

n°04 710 444 001) est utilisé avec 0,4 µM pour chacune des amorces pour un volume de réaction de 25 µL. Les autres PCR sont préparées avec le kit GoTaq DNA Polymerase (Promega M3175) dans un volume final de 15µL en utilisant 0,2 µM de chaque amorce ; 0,2 mM de chaque dNTP et 0,375U d’enzyme par réaction.

2.1.5 Electrophorèse sur gel d’agarose

Une fois les réactions d’amplification terminées, une étape d’électrophorèse sur gel d’agarose de 0,8 à 2 % préparé dans du TAE 0,5X (Tris, Acétate, EDTA pH8) permet de séparer les amplicons en fonction de leur taille.

La migration se fait dans un tampon TAE 0,5X à 100V pendant 20 à 30 minutes selon les PCR. Le gel est ensuite incubé pendant 15 minutes dans un bain de TAE 0,5X avec du bromure d’éthidium (BET) à 0,5 µg/mL. Cette molécule va s’intercaler entre les brins d’ADN amplifiés. Le gel est exposé à une lumière UV à 250 nm, le BET est excité et devient fluorescent rouge-orange ce qui permet la visualisation des bandes amplifiées. Un marqueur de poids moléculaire adapté (50 pb, 200 pb ou 1 kb) à la taille des fragments est déposé sur chaque gel ainsi que des contrôles négatifs (H₂O à la place de l’ADNg) et positifs (des échantillons des génotypes attendus).