4. Effets de l’inactivation de Ncl au cours du développement
4.1 Etude de l’inactivation de Ncl dans la lignée « NCL Nestin-Cre »
4.1.5 L’inactivation de Ncl provoque des anomalies comportementales et cérébrales
La protéine NCL était connue pour être requise pour des cellules en culture et nous avons retrouvé ce caractère vital au cours des croisements. De plus, des phénotypes inattendus ont été observés en particulier chez les animaux mosaïques Ncl+/fl/; Nestin-Cre +/- adultes et les souriceaux mort-nés.
4.1.5.1 L’haploinsuffisance de Ncl entraîne un comportement anormal
Parmi les animaux ayant la délétion pour Ncl, seules les souris mosaïques Ncl+/fl/;
Nestin-Cre+/+ ou +/- sont viables. Vers 7-8 mois, elles commencent à trembler et présentent une anomalie dans leurs déplacements : elles titubent, leur train arrière s’affaisse de manière plus ou moins brusque lors de leur marche comme si elles avaient une perte d’équilibre ou une faiblesse musculaire. Leur queue est positionnée à la verticale et leurs pattes arrière semblent plus écartées que celles des souris contrôles. Elles paraissent moins actives dans leur cage et restent principalement dans les coins sans beaucoup bouger. Certaines présentent parfois des comportements de grande excitation, en particulier un comportement de heurt de la grille des cages par des sauts répétés.
4.1.5.2 La viabilité requiert la présence des deux allèles sauvages de Ncl.
Lors du suivi des naissances pour les croisements de souris Ncl+/fl/ ; Nestin-Cre+/- entre elles ou avec des souris Nclfl/fl, des mort-nés ont été trouvés dans les portées. C’est un phénomène connu chez les souris et cela arrive régulièrement avec des proportions variables selon le fond génétique. Le Tableau VII est une synthèse des naissances, pour les croisements cités
précédemment, en incluant les morts nés identifiés. Les observations ont mis en évidence trois ensembles de génotypes.
Tableau VII – Synthèse des naissances de plusieurs croisements incluant les mort-nés pour chaque génotype.
Croisements utilisés : Ncl+/fl/ ; Nestin-Cre+/- x Ncl+/fl/ ; Nestin-Cre+/- et Ncl+/fl/ ; Nestin-Cre+/- x Nclfl/fl. Les génotypes sont regroupés en fonction de leur viabilité.
Naissances Génotypes observables à l’âge adulte Nombre total Dont mort-nés % des mort-nés par génotype Ncl+/+; Nestin-Cre-/- 4 1 25% Ncl+/+; Nestin-Cre+/+ ou +/- 17 6 35% Ncl+/fl; Nestin-Cre-/- 26 4 15% Ncl+/fl; Nestin-Cre+/+ ou +/- 3 2 67% Ncl+/fl/; Nestin-Cre+/+ ou+/- 91 19 21% Nclfl/fl; Nestin-Cre-/- 21 4 19%
Total génotypes viables 162 36 22% Naissances
Génotypes restreint des animaux mort-nés Nombre total Dont mort-nés % des mort-nés par génotype Ncl+/; Nestin-Cre+ 1 1 100% Nclfl/fl; Nestin-Cre+/- 1 1 100% Nclfl/; Nestin-Cre-/- 1 1 100% Nclfl/; Nestin-Cre+ 49 49 100%
Total génotypes non viables 52 52 100% Génotypes non observés
Ncl+/; Nestin-Cre -/-Ncl/; Nestin-Cre -/-Ncl/; Nestin-Cre+/+ ou
+/-Un premier groupe de souris a des génotypes compatibles avec le développement jusqu’à l’âge adulte même si quelques mort-nés sont présents dans chaque génotype.
Le deuxième groupe rassemble les génotypes qui ne sont observés que chez les souriceaux mort-nés. Tous se développent in utero avec un corps normal mais avec des phénotypes cérébraux différents selon les génotypes, ce point sera évoqué ci-après. Des expériences complémentaires sont nécessaires pour déterminer à quel moment (au cours du développement ou à la naissance) ces souris meurent. Comme il n’y a qu’une seule souris concernée pour chacun des génotypes Ncl+/; Nestin-Cre+, Nclfl/fl; Nestin-Cre+ et Nclfl/; Nestin-Cre-/-, il est difficile de conclure.
Enfin le troisième ensemble contient les génotypes qui n’ont jamais été observés dans les portées. Il s’agit des souris KO pour Ncl et des souris hétérozygote (+/. Comme un mutant
Nclfl/ ; Nestin-Cre-/- a été détecté, il est possible que le nombre de naissance n’était pas suffisant pour obtenir le mutant Ncl+/; Nestin- Cre-/-.
4.1.5.3 Ncl à l’état hétérozygote est nécessaire au développement du système nerveux central.
Parmi les souris obtenues, deux groupes présentent des anomalies cérébrales plus ou moins sévères.
Les souris mosaïques Ncl+/fl/ ; Nestin-Cre+/- adultes ayant un comportement anormal, la question s’est posée de vérifier que le phénotype observé est dû à un problème nerveux comme attendu puisque Cre s’exprime principalement dans le système nerveux, ou si au contraire, ce phénotype était lié à un défaut musculaire, Cre s’exprimant aussi dans ce tissu. Lors de prélèvements d’organes dont le cerveau, nous avons pu constater que le cervelet de la souris mosaïque est plus petit que celui des souris contrôles. Ces anomalies sont retrouvées avec le transgène Nestin-Cre (FT) et seront détaillées dans la partie 4.2.
Parmi les souris mort-nées, les souris Nclfl/; Nestin-Cre+ présentent macroscopiquement une tête rouge œdématiée. A la dissection, la boîte crânienne est très fine et contient ce qui peut être un mélange de sang et de liquide céphalo-rachidien. Chez le mort-né de génotype contrôle Ncl+/+ ; Nestin-Cre+/- le cerveau est visible et apparemment bien formé comme le montre la Figure 20. Les souris Nclfl/ ; Nestin-Cre+/+ ou+/- ont donc un développement du cerveau très limité voire inexistant.
Contrairement aux souriceaux mort-nés Nclfl/; Nestin-Cre+ qui sont des KO complets pour
Ncl dans le cerveau, les souriceaux Ncl+/; Nestin-Cre+/+ ou +/- et Nclfl/; Nestin-Cre-/-, également mort-nés, ne sont pas anencéphaliques. Un allèle sauvage est donc suffisant pour un développement du cerveau. Ce développement n’est sûrement pas normal étant donné que l’haploinsuffisance vue chez les souris mosaïques Ncl+/fl/
; Nestin-Cre+/- entraîne des anomalies. Une étude histologique permettrait de vérifier cette hypothèse.
Figure 20 – Morphologie de la tête des mort-nés Ncl+/+ ; Nestin-Cre+/- et Nclfl/ ; Nestin-Cre+/-.
Les souris contrôles (gauche) possèdent un cerveau dans leur boîte crânienne tandis que les souris Nclfl/(droite) ont un
développement cérébral très restreint.
En résumé, la présence de la délétion n’est tolérée qu’à l’état mosaïque chez l’adulte, l’haploinsuffisance stricte conduisant à des souriceaux mort-nés. La perte d’un allèle dans le cerveau, au cours du développement, entraîne des anomalies de structures et de fonctions.
4.2 Etude de l’inactivation de Ncl dans la lignée
« Ncl Nestin-Cre (FT) »
En cours de projet, voyant que la transmission germinale de Ncl est faible et qu’un phénotype cérébral a été détecté, des expériences avec des souris exprimant la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Nestin (FT) sont initiées en parallèle. En effet, non seulement le transgène Nestin-Cre (FT) cible plus spécifiquement le cerveau mais il semble aussi faciliter la transmission d’un gène muté dans la lignée germinale. Cela a été effectivement observé dans notre laboratoire pour un projet similaire à celui-ci.