Le compartiment à colonnes thermostaté (Module G1316C)

Le compartiment à colonne est divisé en deux fours et peut contenir jusqu’à 8 colonnes de 50 mm de longueur ou 6 colonnes de 250 mm de longueur. Ce compartiment est constitué d’une zone de chauffage pour la phase mobile, à travers un capillaire de 6µL de volume, avant que celle-ci ne pénètre dans les colonnes. Le capillaire de gauche en sortie de colonne est fixé à 37,5°C afin de minimiser le bruit de fond et à un volume de 3 µL. Ces fours permettent de thermostater la phase mobile et la ou les colonnes utilisées. Le chauffage de la phase mobile permet de diminuer le bruit de fond et celui de la colonne permet de faire varier la sélectivité, ce qui permet d’améliorer la séparation des pics.

Ce chauffage est homogène de façon à obtenir des temps de rétention reproductibles. Les compartiments à colonnes pouvant contenir plusieurs colonnes chromatographiques, il est ainsi possible de switcher d’une colonne à l’autre et effectuer du criblage de colonnes lors de l’optimisation et du développement de méthode.

~ 68 ~ 6. Le détecteur UV-DAD (Module G1315C)

Il est équipé d’une cellule de détection de trajet optique de 6 mm ou 10 mm de long. Cette cellule résiste à de hautes pressions (jusqu’à 400 bar) et est pourvue d’un court tube de transfert, ce qui minimise l’élargissement des pics. Les volumes morts des cellules UV de 6 mm et 10 mm sont respectivement de 5 µL et 13 µL.

Plusieurs autres types de détecteurs peuvent fonctionner avec ce système SFC dont l’ELSD, la MS mais aussi le détecteur FID depuis juillet 2013 ; cependant ce détecteur ne peut être utilisé que lorsque la phase mobile est constituée à 100% de CO2, ce qui implique qu’il s’agisse de composés apolaires comme les hydrocarbures par exemple. Le logiciel « Chemstation software » pilote cet instrument indépendamment du spectromètre de masse.

3.2.2. Le Q-TOF 6540 Agilent Technologies

Le spectromètre de masse installé au laboratoire est un instrument hybride de type Quadripôle-Temps de vol de chez Agilent Technologies, désigné par l’appellation Q-TOF 6540. Différents types de sources d’ionisation peuvent être installées sur cet instrument : ESI, APCI, APPI, Multimodes (Source permettant de travailler en ESI et en APCI).

3.2.2.1. Les sources d’ionisation ESI, APCI et APPI installées sur le Q-TOF 6540 Ces 3 sources seront utilisées lors des expériences présentées dans ce manuscrit. La source multimode n’est pas disponible au laboratoire et ne sera donc pas décrite.

 Les sources ESI DUAL et ESI DUAL Jet Stream (JS)  La source ESI DUAL

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Figure 36 : Photo de la source ESI Agilent Technologies (Manuel Agilent Technologies) La chambre de la source ESI à 3 composants ayant des fonctions importantes :

 Le nébuliseur

Celui-ci rentre à l’intérieur de la source ESI et arrive au niveau du bloc noir où est générée la haute tension. Un deuxième nébuliseur arrive à 45° du nébuliseur principal afin de permettre l’arrivée des composés de référence, qui sont infusés en continu au niveau de la source. La pression appliquée sur ce nébuliseur se situe entre 30 et 60 psi. Ce paramètre dépend du débit de la phase mobile.

 La température et le débit du « drying gas » (DG)

Le « drying gas » (DG) aide à la désolvatation de la phase mobile. Plus le débit de la phase mobile en chromatographie augmente et plus le débit du DG devra être élevé afin de désolvater totalement la phase mobile. Cependant, la diminution de la température du DG permet de diminuer la formation d’adduits sodium. Les températures et débit applicables sur cette source sont de 250-350°C et 5-12 L/min, respectivement. Ces paramètres, ainsi que la tension du capillaire (2000-6000 V), sont interdépendants et dépendent du débit de la phase mobile (débit maximal conseillé de 1mL/min).

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 La source ESI Dual Jet Stream (JS)

Figure 37 : Photo de la source ESI DUAL Jet Stream (ESI JS) Agilent Technologies (Manuel Agilent Technologies)

La source ESI JS diffère de la source ESI de par la présence d’une arrivée d’azote chauffé supplémentaire parallèlement au nébuliseur. Celle-ci permet d’améliorer la désolvatation de la phase mobile de par la température élevée du flux de gaz inerte. Son orientation concentrique et parallèle au spray permet de réduire la dispersion des ions à l’arrivée dans la source. Ainsi, les ions entrent en plus grand nombre dans le capillaire du spectromètre de masse et la sensibilité est améliorée.

Ce gaz additionnel est nommé « Sheat gas ». Les gammes de températures et débits applicables sont de 250-400°C et de 8-12 L/min respectivement. Ces 2 paramètres sont inter-dépendants.

Un autre paramètre appelé « nozzle »est une électrode située à la sortie de la source. Elle aide les molécules à s’ioniser plus facilement en y ajoutant un voltage. Généralement, le voltage est compris entre 0 – 500 V pour l’ionisation positive et entre 1000 – 2000 V pour l’ionisation négative. Ce paramètre est composé-dépendant.

 La source APCI

L’ionisation de la phase mobile et des composés par APCI est basée sur une décharge corona. En APCI, 4 paramètres nécessitent d’être optimisés afin d’obtenir une bonne sensibilité :

~ 71 ~  Le nébuliseur

La phase mobile arrive dans le nébuliseur et passe à travers une aiguille en acier inoxydable. Un courant d’azote passe à travers le nébuliseur et permet la transformation du la phase mobile en fines gouttelettes. Ce courant d’azote va permettre de transporter les gouttelettes vers la chambre d’ionisation. Il peut varier entre 30 et 60 psi. Il dépend du débit de la phase mobile.

 Le vaporiseur

Il est constitué d’un tube chauffé de part et d’autre qui va permettre l’évaporation de la majorité de la phase mobile de l’aérosol formé. La température doit être ajustée en fonction de la volatilité de la phase mobile, mais elle est généralement fixée à 350°C. Plus le débit de la phase mobile appliqué est élevé et plus la température du vaporiseur devra être élevée afin que la vaporisation soit la plus complète possible. Il peut être fixé entre 300 et 500°C.

 L’aiguille corona

La décharge se produisant au bout de l’aiguille corona génère des électrons. Ces électrons vont alors engendrer une série de réactions chimiques qui vont permettre in fine l’ionisation des molécules d’analytes. Le courant de décharge de l’aiguille corona est dépendant de l’échantillon. Le courant en mode positif se situe entre 0 - 10 nA et 0 - 100 nA en mode négatif.

 La température du « drying gas »

Le « drying gas » permet d’évaporer la phase mobile restante et de désolvater totalement l’analyte. Il est généralement fixé à un débit de 4-5 L/min, beaucoup plus faible qu’en ESI (de l’ordre de 10 L/min) car le vaporiseur permet l’évaporation de la majorité de la phase mobile. La température du « drying gas » dépend de son débit, de la stabilité de l’analyte et du débit de la phase mobile. Elle peut prendre des valeurs entre 0 – 350°C. Elle dépend du débit de la phase mobile.

Aussi la tension du capillaire (2000 - 4500 V) et le débit du « drying gas » (4 – 12 L/min) sont des paramètres importants à optimiser avant analyse. La tension appliquée sur le capillaire est composé-dépendante.

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Figure 38 : Photo de la source APCI Agilent Technologies (Manuel Agilent Technologies)

L’acétonitrile n’est pas recommandé en APCI car il accélère la formation de dépôts de carbone sur l’aiguille corona, ce qui diminue le courant d’ions total.

En APCI, la température de vaporisation est le paramètre le plus important au niveau de l’optimisation. L’augmentation de cette température permet d’obtenir une meilleure désolvatation de l’analyte et par conséquent une meilleure ionisation. Cependant, les risques de décomposition thermique des analytes sensibles à la chaleur, augmentent aussi. Il s’agit de trouver un compromis entre la volatilisation de la phase mobile et la décomposition des analytes.

 La source APPI

La lampe UV en APPI est placée à la même position que l’aiguille corona avec la source APCI. La lampe placée sur cette source est une lampe à décharge au Krypton, émettant des photons à une énergie de 10,0 et 10,6 eV.

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Figure 39 : Photo de la source APPI Agilent Technologies (Manuel Agilent Technologies)

Les paramètres à optimiser sont les mêmes qu’avec la source APCI. La lampe UV remplace l’aiguille corona de la source APCI.

3.2.2.2. Les caractéristiques de l’analyseur de spectrométrie de masse : le Q-TOF 6540

L’instrument que nous avons au laboratoire est un spectromètre de masse hybride de type quadripôle-temps de vol. Celui-ci permet d’obtenir une haute précision en masse de l’ordre de quelques ppm ainsi qu’une résolution en masse élevée pouvant atteindre 40 000 pour un

m/z à 922, par exemple.

~ 74 ~ Sensibilité en mode MS et MS/MS : Réserpine m/z 609,2806 2 pg, S/N 10 :1 MS 2 pg, S/N 50 :1 MS/MS Précision en masse ^{40 pg injecté : < 1 ppm MS}

100 pg injecté : < 2 ppm MS/MS

Résolution ^{> 25000 m/z 322}

> 40000 m/z 1522

Gamme dynamique 5 ordres de grandeur

Gamme de masse ^{quadripôle 0 - 4000}

TOF 0 - 10000

Vitesse de scan ^{20 scan/s MS}

10 scan/s MS/MS Tableau 10 : Différentes spécifications pour le Q-TOF 6540 Agilent

Il est possible de travailler sous 2 modes d’acquisition: ces modes sont désignés par la fréquence 2 ou 4 GHz. Il s’agit de la fréquence du « digitizer ». Par exemple, en mode 2 GHz l’acquisition des points sur le spectre se fera toutes les 0,5 ns. En mode 4 GHz les acquisitions se feront toutes les 0,25 ns. Ainsi, le mode 2 GHz permettra d’obtenir une plus grande gamme dynamique que le mode 4 GHz mais une résolution plus faible du fait du nombre inférieur de points pour définir un pic.

Les différentes parties constituant le QqTOF 6540 sont schématisées sur la figure 40 et décrites en détails par la suite.

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Figure 40 : Schéma des différentes parties du Q-TOF 6540 Agilent (Par Agilent Technologies)

Valeurs du vide dans le spectromètre de masse

Compartiments

Pression (avec gaz de collision)

(bar)

Pression (sans gaz de collision)

(bar) Chambre de désolvatation ^2.10 -3 - 3.10-3 - Octopôle 3. 10-4 - Lentilles/Quadripôle 3.10-7 - Cellule de collision 2.10-6 3.10-9 Tube de vol 2.10-10 1.10-10

Tableau 11 : Différentes valeurs du vide dans le spectromètre de masse Q-TOF 6540 avec et sans cellule de collision

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 Le bloc de désolvatation

Figure 41 : Différentes parties du bloc de désolvatation (Par Agilent Technologies)

Ce bloc de désolvatation consiste en un tube acheminant le « drying gas », une unité de chauffage de ce gaz, un détecteur et un isolant thermique. Le « drying gas » est de l’azote chauffé qui est acheminé à un débit entre 3 et 12 L/min , situé avant l’entrée des composés dans le capillaire afin d’éliminer les microgouttes de solvants encore présentes.

Les ions formés dans la source à pression atmosphérique arrivent ensuite à l’entrée d’un capillaire recouvert de platine à chaque extrémité, permettant l’application d’une différence de potentiel. Les ions sont acheminés vers des lentilles qui permettront leur focalisation avant d’entrer dans le quadripôle. Le potentiel à l’entrée du capillaire est typiquement de - 4000 V à l’entrée et de + 150 V à la sortie en mode d’ionisation positif. Les composés sont désolvatés et focalisés à l’intérieur du capillaire. Ce capillaire nécessite d’être nettoyé de façon régulière en raison de la possible formation d’une couche isolante sur les parois due aux résidus de solvants et d’échantillons. Cela entraine une diminution de la transmission des ions, spécifiquement pour des rapports m/z faibles.

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Figure 42 : Photo du capillaire de transfert de l’échantillon dans le spectromètre de masse (Par Agilent Technologies)

 Le « skimmer » et l’octopôle

A la sortie du capillaire, les ions vont être accélérés vers un « skimmer ». Ce skimmer est constitué d’un cône en platine et va agir comme une lentille en éliminant l’excès de gaz neutre et de molécules de solvant neutres à l’entrée du spectromètre de masse.

Figure 43 : Vue de la sortie du capillaire de transfert et du skimmer avant l’entrée de l’échantillon dans l’octopôle (Par Agilent Technologies)

Les ions les plus lourds seront focalisés au niveau de l’entrée du « skimmer » tandis que les ions les plus légers et les molécules neutres (eau évaporée, N2, O2) seront pompés directement par le système de pompes turbo-moléculaires au niveau de l’octopôle.

L’octopôle permet de transporter et de focaliser le faisceau d’ions avant leur entrée dans le quadripôle. Celui-ci est constitué de 8 barreaux sur lesquels sont appliquées des différences de potentiel, et dont les barreaux adjacents ont des tensions opposées. Ce type de guide d’ions transmet tous les ions dans la gamme d’utilisation de l’analyseur TOF.

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Entre le capillaire et le skimmer, certaines fragmentations peuvent avoir lieu. De ce fait, la tension du « fragmentor » (120-240 V), espace entre le capillaire et le « skimmer », doit être optimisée pour minimiser la fragmentation des ions. Les tensions classiquement utilisées se situent entre 145 et 165 V pour des ions de rapports m/z supérieurs à 1000 et entre 175 et 225 V pour les ions de rapports m/z inférieurs à 1000.

 Les lentilles de focalisation des ions

Figure 44 : Vue de l’octopôle et des différentes lentilles de focalisation des ions avant leur entrée dans le quadripôle (Par Agilent Technologies)

Ces lentilles sont des lentilles électrostatiques : elles sont constituées d’une partie permettant de décélérer le faisceau d’ions dans un premier temps puis de le réaccélérer ensuite en le focalisant. Les lentilles 1 et 2 permettent de maximiser le signal et de minimiser la contribution du bruit. La deuxième lentille à une tension identique à celle du quadripôle. Par exemple, si les tensions au niveau du quadripôle et de l’octopôle sont de 5 et de 0 V respectivement, les ions auront une énergie de 5 eV. En fonction de leur énergie cinétique, les ions vont traverser plus ou moins vite le quadripôle.

 Le quadripôle

Le quadripôle peut être utilisé en mode MS simple, en mode « SIM » signifiant « single ion monitoring » et en mode MS/MS.

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En mode MS simple, il va permettre seulement de guider les ions vers l’analyseur à temps de vol alors qu’en mode MS/MS il va permettre de sélectionner les ions (fenêtre choisie de 1 à 3 Thomson) qui se fragmenteront ensuite dans la cellule de collision.

Figure 45 : Vues de l’intérieur du quadripôle et des 4 barres cylindriques entrent lesquelles passent les ions (Par Agilent Technologies)

Suivant les versions du QqTOF, il est possible d’avoir un quadripôle ou un hexapôle en tant que guide d’ions en Q0 ou en Q2. Sur le système Agilent 6540, un quadripôle sert de guide d’ions.

 La cellule de collision

La cellule de collision est remplie de gaz, en général de l’azote. L’azote arrive directement dans la cellule et la pression est d’environ 1.10-5 bar.

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Figure 46 : Schéma de la cellule de collision constituée d’un hexapôle et permettant la fragmentation des ions (Par Agilent Technologies)

Celle-ci est constituée d’un hexapôle, qui se compose de 6 barreaux cylindriques autour desquels sont appliquées des tensions alternatives et continues opposées 2 à 2. Les ions entrent dans l’hexapôle et vont se fragmenter selon l’énergie de collision appliquée et le gaz présent. Si l’énergie de collision est suffisante, un excès d’énergie vibrationnelle va permettre à la molécule de se fragmenter tout d’abord par rupture des liaisons les plus faibles.

En mode MS simple, aucune pression de gaz de collision n’est appliquée, seulement une faible différence de potentiel permettant le passage des ions à travers la cellule.

Le choix d’un hexapôle en tant que cellule de collision permet d’avoir une bonne focalisation et transmission des ions, propriétés respectivement spécifiques au quadripôle et à l’octopôle. En effet, un quadripôle privilégie la focalisation des ions : le puits de potentiel présente un creux et augmente rapidement quand l’ion s’éloigne de l’axe, ceci étant lié à la géométrie du quadripôle. Cet élément permet donc une bonne focalisation des ions et l’obtention d’un faisceau d’ions très fin, mais possède une mauvaise transmission en raison des pertes d’ions importantes dues aux effets de charge et à la déviation de leur trajectoire par collision avec des molécules gazeuses résiduelles. L’octopôle privilégie la transmission des ions : celui-ci présente un puit de potentiel ayant une faible valeur autour du centre et une forte valeur près des bords, ce qui permet d’obtenir une bonne transmission simultanée des ions sur une large gamme de masse.

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 « L’ion beam compression »

Figure 47 : Schéma de la zone constituée de différentes lentilles entre la sortie de la cellule de collision et l’entrée dans ions dans le modulateur (Par Agilent Technologies)

À la sortie de l’hexapôle, les ions sont refocalisés pour former un faisceau d’ions très fin par un système appelé « ion beam compression » avant de passer par un « slicer » puis par le modulateur et entrer dans le tube de vol. La technologie de « l’ion beam compression » permet d’augmenter la résolution du Q-TOF et d’atteindre une résolution d’environ 40 000 pour m/z 922.

 Le « slicer »

Figure 48 : Photographie du « slicer » permettant l’affinage du faisceau d’ions (Par Agilent Technologies)

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A la sortie de la cellule de collision, les ions présentent une distribution en énergie de quelques électronvolts due aux quelques collisions ayant eues lieu avec les molécules de gaz neutre. Les ions vont alors passer dans un tube appelé « slicer ».

Le slicer est constitué d’un tube cylindrique possédant une fente à l’entrée et à la sortie. Celui-ci permet de former un faisceau d’ions très fin et d’obtenir un alignement correct du faisceau d’ions. Aussi, le slicer permet d’avoir une distribution en énergie cinétique la plus faible possible. Cependant, le faisceau formé présente une certaine épaisseur entraînant une distribution spatiale des ions.

Plus le faisceau d’ions sera focalisé et aligné et meilleure sera la résolution en masse. Un faisceau défocalisé entrainerait un élargissement de pic et une mauvaise résolution en masse.

 Le Modulateur

Figure 49 : Schéma et photographies du modulateur et des différentes plaques empilées le constituant (Par Agilent Technologies)

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Le modulateur est constitué d’une série de plusieurs plaques empilées et possède un trou central sur lequel est appliqué une haute tension de 10 kV.

En quittant la cellule de collision, les ions sont ensuite ré-accélérés à quelques dizaines d’électronvolts par unité de charge, avant d’entrer dans le modulateur de l’analyseur à temps de vol. Les ions arrivant du slicer présentent une très faible distribution en énergie cinétique et partiront d’une position identique vers le tube de vol. Les paquets, une fois constitués, entrent dans une zone d’accélération où ils acquièrent une énergie de quelques keV par charge à l’aide d’un champ électrique uniforme. Le champ électrique à une fréquence de plusieurs kiloHertz. Les ions étant éjectés vers le tube à cette fréquence, leur temps de vol maximal est de quelques centaines de microsecondes.

 Le tube de vol

Le tube de vol du Q-TOF 6540 a une longueur de 1 mètre environ et permet la séparation des ions en fonction de leur temps de trajet dans le tube et leur arrivée sur le détecteur. Le tube de vol est constitué d’un alliage de faible dilatation. Le coefficient de dilatation est de 1ppm/°C, ce qui permet de s’affranchir des dérives d’étalonnage du système dues à la dilatation du tube de vol. En effet, le temps de vol des ions étant proportionnel à la distance parcourue, une dilatation du tube de vol causerait des modifications de distances parcourues par les ions. La pression à l’intérieur du tube de vol avoisine 2,20 10-10 bar et est nécessaire afin de minimiser toute collision des ions avec des molécules de gaz résiduel et de ralentir leur parcours, ce qui aurait sinon une influence sur la précision en masse et la résolution. Afin d’augmenter la résolution, un miroir électrostatique ou reflectron est positionné à l’extrémité du tube de vol.

Figure 50 : Photographie du miroir électrostatique situé au fond du tube de vol (Par Agilent Technologies)

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3.2.2.3. Détecteurs et convertisseurs

Chaque paquet d’ions sortant du tube de vol est enregistré par le détecteur. Un spectre est ensuite constitué après conversion du temps en numérique par un convertisseur temps-numérique.

Le détecteur sur le Q-TOF 6540 est constitué d’une galette de microcanaux : cette galette est constituée de multiples trous représentant 60% de sa surface. Les ions arrivant à sa