La voie de biosynthèse de l’isobutylthiazole

Nos résultats ont démontré qu’un dérivé de la leucine se condense avec la cystéine pour former de l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique. Ce composé est plus abondant dans les tomates dont l’expression de FMO est faible et pourrait donc être le substrat de FMO. Une expérience d’enrichissement en acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique dans des feuilles de N. benthamiana exprimant transitoirement la FMO et/ou l’enzyme IBTS1 a été réalisée. La protéine FMO a permis la production d’isovaleronitrile, de 1-nitro-3- méthylbutane et d’oxime à partir du substrat exogène. La protéine IBTS1 seule n’a pas engendré de production d’isobutylthiazole mais de l’isobutylthiazole a été produit lorsqu’elle était exprimée concomitamment avec la FMO. Ce résultat signifie que l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique doit d’abord être transformé par la FMO pour être utilisé par l’IBTS1 pour être transformé en isobutylthiazole. De plus, un enrichissement sans le groupe acide carboxylique, c’est-à-dire un enrichissement en 2-isobutyl-1,3-thiazolidine, n’a pas permis aux enzymes de catalyser la production des composés volatils énumérés précédemment. Le groupe acide carboxylique de l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique est donc important pour la FMO pour produire le substrat d’IBTS1 et les composés azotés. La protéine FMO pourrait agir par une oxygénation ou une hydroxylation du soufre ou de l’azote pour former le substrat d’IBTS1. Il semblerait qu’à partir de l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique, deux voies métaboliques divergent ; l’une pour la production des composés azotés et l’autre pour la production de composés azotés et soufrés.

À la vue de nos résultats, deux hypothèses sont envisageables pour la voie métabolique de l’isobutylthiazole dans le fruit de tomate. Dans les deux cas, l’acide isobutylthiazolidine-4- carboxylique serait synthétisé de façon spontanée ou enzymatique à partir de l’isovaleraldéhyde et de la cystéine, puis servirait de substrat au reste du sentier. Selon une première hypothèse, FMO serait responsable uniquement de la formation de la double liaison entre le carbone 2 et l’azote, transformant ainsi l’acide isobutylthiazolidine-4- carboxylique en thiazoline. Plus précisément, la FMO dirigerait une N-hydroxylation puis spontanément se produirait une désoxygénation de l’azote couplée à une déshydrogénation du carbone 2. Puis, la protéine IBTS1 catalyserait une décarboxylation du thiazoline pour

produire de l’isobutylthiazole. Selon une seconde hypothèse, la FMO entraînerait un clivage et une décarboxylation de l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique. Une S-hydroxylation par la protéine FMO pourrait enclencher spontanément une désoxygénation/déshydrogénation du produit, suivie d’une décarboxylation pour former du 2-[(3-méthylbutyl)amino]éthanethiol. À partir du 2-[(3-méthylbutyl)amino]éthanethiol, la protéine IBTS1 pourrait catalyser une cyclisation pour former de l’isobutylthiazole. Cette hypothèse permet aussi de conjecturer sur la production d’oxime, de nitrile et de nitro. En effet, à partir du 2-[(3-Methylbutyl)amino]ethanethiol, la protéine FMO pourrait catalyser une simple ou double N-hydroxylation, pour ensuite engendrer un clivage du 3-méthylbutanal oxime et la production du 1-nitro-3-méthylbutane et de l’isovaleronitrile.

F ig u re 27 : V o ies mé ta b o liq u es h yp o th ét iq u es po u r l’iso b u tyl th iaz o le

Pour confirmer ces deux hypothèses, il faudra identifier, par des analyses d’UPLC, le substrat d’IBTS1 (l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique ou le 2-[(3- méthylbutyl)amino]éthanethiol) pour ensuite effectuer des tests enzymatiques in vitro avec la protéine purifiée. Pour la protéine FMO, une confirmation in vitro devra être réalisée avec l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique pour vérifier s’il s’agit bien de son substrat et comprendre comment les composés azotés et le substrat d’IBTS1 sont synthétisés. Ces connaissances permettent d’établir une nouvelle voie métabolique pour les composés azotés et les composés azotés et soufrés. Les voies métaboliques connues des composés azotés tels que les oximes, les nitriles et les nitros reposent principalement sur les protéines cytochromes P450 (CYP71, CYP79, CYP83). Les protéines CYP 71 et 79 ont été caractérisées dans plusieurs espèces telles que le peuplier (Irmisch et al., 2013), le sorgho (Luck et al., 2016), l’orge (Knoch et al., 2016) et la coca (Sibbesen et al., 1995). Ces protéines réalisent une décarboxylation et une N-hydroxylation des acides aminés pour engendrer la production de composés oximes, nitriles et nitros (Sørensen et al., 2018). Par exemple, la CYP79 du peuplier utilise la leucine pour produire du 3-méthylbutyraldoxime, qui est ensuite converti en isovaleronitrile et en 1-nitro-3-méthylbutane. L’azote de ces composés provient donc directement de la leucine chez cette espèce. Chez la tomate, l’azote de ces mêmes composés volatils azotés semble provenir plutôt de la cystéine, un exemple du fait qu’il existe chez les plantes plusieurs sentiers métaboliques chez les plantes pour produire les mêmes molécules.

Dans le règne végétal, la cystéine sert de précurseur à plusieurs composés azotés et soufrés tels que des oximes, des isothiocyanates, des thiocyanates, des épithionitriles, des oxazolidines et des thiazolidines. Les connaissances actuelles sur les voies de biosynthèse de ces composés est limitée. L’un des sentiers connus est celui des glucosinolates, des composés spécifiques aux brassicacées. Les glucosinolates dérivent d’un acide aminé auquel est ajouté un glucose et deux soufres, dont l’un est issu d’une cystéine. Une CYP79 synthétise d’abord des aldoximes à partir d’acides aminés puis CYP83 les utilise pour produire un composé nitro. Ce dernier est fusionné à un composé soufré dérivé de la cystéine puis serait modifié par plusieurs enzymes. Enfin, une glucosyltransférase et une sulfotransférases ajoutent, respectivement, un glucose et un sulfate à la molécule pour former un glucosinolate. (Halkier et Gershenzon, 2006). Les glucosinolates peuvent ensuite être soumis à différentes réactions enzymatiques pour produire de nombreuses molécules. Des embranchements en amont dans le sentier des glucosinolates permettent aussi de

produire d’autres types de molécules soufrées, comme la camalexine. La synthèse de ce dernier composé débute par la condensation de l’indole-3-acétonitrile (issu du tryptophane) et de la cystéine. L’indole-3-acétonitrile-cystéine produit est ensuite cyclisé par une CYP 450 pour former un thiazoline. La même enzyme réalise ensuite une décarboxylation pour produire la camalexine (Ahuja et al., 2012). Une expérience d’enrichissement en cystéine marquée a montré que l’azote du thiazole de la camalexine provient de la cystéine et non du tryptophane (Zook et al., 1997). Bien que les réactions enzymatiques menant à la synthèse de l’isobutylthiazole et de la camalexine soient différentes, l’azote de l’anneau thiazole provient donc dans les deux cas de la cystéine.

Le sentier de l’isobutylthiazole proposé dans cette étude est unique sur plusieurs aspects. Les voies métaboliques impliquées dans la synthèse des autres composés avec un anneau thiazole impliquent en effet des types d’enzymes très différents et les intermédiaires ne partagent pas les mêmes groupements chimiques. Aucune FMO n’avait été formellement associée à la synthèse des composés volatils azotés, ce qui permet d’agrandir le spectre d’activité de cette famille de protéines. La protéine IBTS1 est également la première PR10 caractérisée à synthétiser des thiazoles. Bien qu’IBTS1 semble spécifique à certaines espèces du genre Solanum, cette découverte pourrait permettre de mieux comprendre les fonctions biologiques des PR10.

Dans la tomate, on a constaté que les plantes transgéniques pour le gène IBTS1 avaient également un contenu modifié en propylthiazole et en autre thiazole inconnu qui semble avoir un carbone supplémentaire à l’isobutylthiazole. Il se pourrait que d’autres composés aldéhydes se condensent avec la cystéine pour former un acide thiazolidine-4-carboxylique, qui par la suite serait utilisé par la FMO et transformé par IBTS1 en thiazole. D’ailleurs, les tests effectués ici avec le pentanal vont dans ce sens. En effet, il a été possible, à partir de ce composé, de produire du 2-butylthiazole. Une meilleure connaissance d’IBTS1 pourrait ouvrir la porte à la production de thiazoles variés possédant des flaveurs diverses.

Conclusion

Cette étude avait pour objectif d’améliorer nos connaissances sur la voie de biosynthèse de l’isobutylthiazole dans le fruit de la tomate. Elle a permis d’identifier un gène qui est responsable de la synthèse de l’isobutylthiazole. Elle a également permis d’identifier un intermédiaire du sentier, l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique, qui provient de la fusion de l’isovaleraldéhyde et de la cystéine. L’implication de la protéine FMO dans le sentier de l’isobutylthiazole et des composés azotés issus de la leucine a aussi été démontrée. À moyen terme, il serait intéressant d’identifier les mécanismes de régulation de ces gènes et du sentier métabolique dans son ensemble. Une étude plus approfondie de la synthèse de l’acide isobutylthiazolidine-4-carboxylique serait aussi pertinente pour comprendre comment le sentier métabolique de la cystéine est connecté à celui de la leucine. Les découvertes sur le sentier métabolique des composés volatils azotés permettront par ailleurs des applications à plus long terme. En effet, en utilisant des marqueurs moléculaires associés à l’expression de ces gènes, les sélectionneurs pourront éventuellement développer des variétés avec un bon contenu en isobutylthiazole ou en 1-nitro-3- méthylbutane, des composés importants pour l’arôme de la tomate.

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