La voie AKT/mTOR chez diff´ erents Eucaryotes

Principaux r´esultats pour la voie

AKT/mTOR

5.3.1 Analyse phylog´en´etique

A partir de la liste des 62 identifiants UniProtKB des prot´eines de la voie AKT/mTOR, j’ai lanc´e EPINe avec les param`etres pr´esent´es dans la table de l’an-nexe C.2. Le plus petit jeu de donn´ees, correspondant aux homologues de la pro-t´eine AKTS1, est compos´e d’uniquement 26 s´equences. Au contraire, les prot´eines AKT1, PDPK1, AAPK1, AAPK2, GSK3A, GSK3B, RAB5A, IGF1R, ULK1 et RHEB poss`edent plus de 1000 homologues, ce qui pose des probl`emes tant au ni-veau du temps d’ex´ecution des logiciels qu’au niveau de l’interpr´etation des arbres phylog´en´etiques correspondants. Parmi ces s´equences, en moyenne 22.37% corres-pondent `a des transcrits alternatifs.

Au niveau de l’alignement, trois diff´erentes options de MAFFT ont ´et´e choisies automatiquement : FFT-NS-2 (pour les 25 plus gros jeux de donn´ees), FFT-NS-i (pour 25 jeux de donn´ees) et L-INS-i (pour les 12 jeux de donn´ees compos´es de moins de cent s´equences). En ce qui concerne la s´election de sites par BMGE, en moyenne seuls 11.23% des sites ont ´et´e conserv´es. Pour certaines prot´eines telles que RPTOR ou DEPTOR, moins de 1% des sites ont ´et´e s´electionn´es. Ceci repr´ e-sentant respectivement 58 et 39 positions pour respectivement 432 et 310 s´equences homologues, les arbres obtenus doivent donc ˆetre interpr´et´es avec pr´ecaution. La meilleure solution restant d’effectuer la reconstruction phylog´en´etique manuelle-ment et d’adapter les param`etres des logiciels utilis´es pour ces jeux de donn´ees.

Les mod`eles ´evolutifs s´electionn´es par ProtTest sont principalement LG+Γ4 et JTT+Γ<sub>4</sub>. L’ex´ecution de ProtTest n’ayant pas abouti pour les prot´eines poss´edant plus de 900 homologues, j’ai choisi d’utiliser le mod`ele LG+Γ₄ pour ces jeux de donn´ees.

5.3.2 La voie AKT/mTOR chez diff´erents Eucaryotes.

A partir des arbres phylog´en´etiques obtenus, j’ai manuellement dat´e l’´emergence de chacune des prot´eines de la voie AKT/mTOR et d´etermin´e les ´ev´enements ´evolutifs qu’elles ont subis de fa¸con analogue `a l’analyse des PI3K. Ainsi, il est possible d’inf´erer la pr´esence ou l’absence d’un g`ene pour un groupe eucaryote

donn´e. Les paragraphes suivants concernent la voie telle qu’elle devait ˆetre chez LECA, chez le dernier ancˆetre commun des Archaeplastida, des Amoebozoa, et enfin des Fungi.

LECA

Parmi les 62 prot´eines de la voie AKT/mTOR (dont onze sont les PI3K humaines de classes I et III), LECA poss´edait d´ej`a 18 g`enes correspondant `a 25 prot´eines humaines (Figure 5.8). Quatre prot´eines suppl´ementaires (SIN1, RBCC1, RHEB et TSC2), ´etaient peut ˆetre cod´ees par le g´enome de LECA, n´eanmoins l’absence de s´equences de plantes et d’Excavata coupl´ee `a l’incertitude du placement de LECA dans l’arbre eucaryote ne nous permet pas de conclure pour ces prot´eines.

mTOR2 mSIN1 deptor MLST8 PRR5 RICTOR TSC1 KAT5 TSC2 AMPK ^p53 GSK3A GSK3B AKT1 INS Gβγ FOXO3 IRS1 GPCRs p87-101 IGFR1 Gα PIK3CG AKT1S1 mTOR1 ATG13 TFEB 1433G/Z BIRC5 ULK1 ATG101 RB1CC1 RPTOR rps6 RAGA/B RHEB p70s6k RAGC/D SH3BP4 HMGB1 PIK3C3 PIK3R4 BAKOR BECN1 RAB5A BCL2L1 AMBRA1 SH3GLB1 UVRAG MDM2 RUBIC BCL2 PDPK1 PIK3CA PIK3R1 PIP2 PTEN PIP3 PI3K classe IB PI3K classe IA PI3K classe III

Homologues 1:1 (mais absence des plantes ou des Excavata)

Homologues 1:1 Homologues X:1

Elément non protéique Protéines non intégrées dans l'étude

Beaucoup de paralogues, analyse plus détaillée en cours

Figure 5.8 – Voie AKT/mTOR de LECA Les prot´eines pr´esentes et absentes du g´enome de LECA sont repr´esent´ees respectivement en bleu et en transparent. Le bleu clair indique que les prot´eines ont subi des duplications chez certains groupes d’Eucaryotes. Graphique g´en´er´e `a l’aide de Cytoscape.

De fa¸con int´eressante, les prot´eines clefs comme Beclin et mTOR ´etaient d´ej`a pr´esentes en une seule copie chez LECA. La troisi`eme prot´eine centrale, AKT1 n´ e-cessite une analyse phylog´en´etique plus approfondie. En effet, de nombreuses dupli-cations ont eu lieu et le jeu de donn´ees compos´e de 1326 prot´eines est difficilement interpr´etable en l’´etat. N´eanmoins, un r´esultat int´eressant est que la duplication

`

a l’origine des prot´eines AKT1, AKT2 et AKT3 humaines semble avoir eu lieu avant la divergence des Euteleostomi, sugg´erant la pr´esence d’une seule copie chez la majorit´e des Eucaryotes.

Les Archaeplastida

Peu d’´ev´enements ´evolutifs se sont produits depuis LECA jusqu’au dernier an-cˆetre commun des plantes. Seule le g`ene codant pour la prot´eine RICTOR a ´et´e perdu dans l’ensemble de cette lign´ee eucaryote. A noter que malgr´e la pr´esence d’homologues de SIN1 et de RBCC1 chez les SAR et les Unikonta, aucune s´equence de plante n’a ´et´e d´etect´ee pour ces deux prot´eines. Enfin, parmi les Archaeplastida, seules les algues rouges poss`edent un homologue des prot´eines RHEB, RRAGA, RRAGB, RRAGC et RRAGD, sugg´erant des pertes ind´ependantes chez les plantes vertes.

Les Amoebozoa

Seules quatre esp`eces d’Amoebozoa sont pr´esentes dans la banque de donn´ees de g´enomes complets eucaryotes utilis´ee par EPINe (voir section 5.2.2). Ainsi il est difficile d’´emettre des hypoth`eses solides pour ce groupe eucaryote. N´eanmoins, les 62 arbres phylog´en´etiques montrent qu’une seule prot´eine suppl´ementaire, `a savoir RUBIC, a ´emerg´e depuis LECA jusq’au dernier ancˆetre commun des Amoebozoa. A noter que pour la prot´eine AMRA1, seuls deux homologues cod´es par le g´enome de A. castellanii ont ´et´e d´etect´es, bien que cette prot´eine soit retrouv´ee chez l’ensemble des autres groupes eucaryotes, donc probablement pr´esente chez LECA.

Les Fungi

Si les champignons ont subi les pertes (majeures) des PI3K des classes I et II, seules les pertes des prot´eines AMRA1 et RUBIC dans cette lign´ee ont ´et´e observ´ees dans les 62 arbres phylog´en´etiques (Figure 5.9). Par ailleurs, bien que la pr´esence de deux prot´eines homologues `a mTOR aient ´et´e pr´ec´edemment d´etect´ee chez S. cerevisiae [411], cette duplication ne s’est pas produite chez le dernier ancˆetre com-mun des champignons. En effet, seules quelques lign´ees de champignons poss`edent deux copies de ce g`ene, sugg´erant des duplications secondaires ind´ependantes.

Le croisement des donn´ees des arbres phylog´en´etiques obtenus par EPINe et des donn´ees interactomiques disponibles pour la levure et l’Homme montrent qu’il y a autant d’interactions conserv´ees que perdues entre les homologues de ces deux

organismes (Figure 5.9). De fa¸con surprenante, sept prot´eines (indiqu´ees par une ´etoiles sur la Figure 5.9) sont pr´esentes chez la majorit´e des champignons mais sont absentes chez S. cerevisiae. Il n’est donc pas possible de conclure quant `a la conservation des interactions de ces prot´eines. Enfin, bien que la levure poss`ede un homologue `a la prot´eine RHEB (nomm´e RHBP1), aucune de ses interactions ne semblent ˆetre conserv´ees. On ne peut n´eanmoins pas savoir si ces interactions ont ´et´e test´ees et non d´etect´ees, ou si aucune exp´erience n’a ´et´e r´ealis´ee. En effet, les bases de donn´ees d’interactions r´epertorient la pr´esence des interactions mais n’indiquent g´en´eralement pas les r´esultats n´egatifs des tests d’interactions.

(GTR1) RAGA/B IGFR1 INS (TSC11) RICTOR DPTOR PRR5 mSIN1 SH3BP4 AKT1 p53 BCL2 TSC2 MDM2 GSK3A TSC1 AMPK GSK3B (ESA1)^KAT5 FOXO3 rps6 BIRC5 (BMH1/2) YWHAZ/G UVRAG p70s6k AKT1S1 ATG13 RB1CC1 (rhbp1)^RHEB (KOG1) RPTOR (ATG1)^ULK1 p87-101 PDPK1 PIK3CG PIK3CA PIK3R1 PIP2 PTEN PIP3 IRS1 AMBRA1 RUBIC (VPS30)^BECN1 PIK3C3 HMGB1 BCL2L1 BAKOR RAB5A PIK3R4 (GTR2) RAGC/D Interaction perdue Interaction conservée Interaction spécifique PI3K classe IB PI3K classe IA PI3K classe III

Homologues 1:1 (mais avec peu de séquences de champignon) Homologues 1:1 Homologues X:1

Protéines non intégrées dans l'étude Elément non protéique Beaucoup de paralogues, analyse plus précise en cours Homologue fonctionnel ATG101 SH3GLB1 mTOR2 (TOR2) mTOR1 (TOR1) mLST8 (LST8) TFEB Gβγ GPCRs Gα

Figure 5.9 – Voie AKT/mTOR de l’ancˆ^{etre commun des Fungi.} Le code couleur est le mˆeme que pour la Figure5.8. Les ´etoiles indiquent les g`enes poss´edant un homologue chez des champignons mais absents du g´enome de S. cerevisiae.

Les duplications r´ecentes

La voie AKT/mTOR a connu deux expansions majeures. La premi`ere a eu lieu chez le dernier ancˆetre commun des Metazoa. En effet, de 21 prot´eines chez les Opis-thokonta, la voie est pass´ee `a 35 prot´eines au moment de la divergence des Choa-noflagellida/Metazoa. La seconde expansion a eu lieu chez les Vertebrata dont le dernier ancˆetre commun poss´edait d´ej`a l’ensemble des prot´eines de la voie humaine.

La duplication RRAGC/RRAGD a eu lieu avant la divergence entre les Gnatosto-mata et les Chondrichthyes. Enfin, deux duplications, celles de Beclin1/Beclin2 et celle de RRAGA/RRAGB, sont plus r´ecentes puisque sp´ecifiques des Mammalia.

5.4 ^Conclusions

Dans cette ´etude, j’ai tout d’abord d´emontr´e qu’un peu plus d’un tiers des pro-t´eines de la voie AKT/mTOR ´etaient d´ej`a pr´esentes chez LECA, notamment les prot´eines clefs telles que les PI3K, mTOR et Beclin. J’ai ´egalement identifi´e plu-sieurs absences majeures chez les plantes, ce qui pourrait en partie expliquer les diff´erences structurelles observ´ees dans le processus d’autophagie de ce groupe eu-caryote. L’analyse de l’interactome de la levure a quant `a lui permis de mettre en ´evidence la conservation d’une partie importante des interactions existantes chez l’Homme. Ces r´esultats sugg`erent donc que ces homologues pourraient exercer la mˆeme fonction biologique. De fa¸con surprenante, il apparaˆıt que les champignons Allomyces macrogynus, Mortierella verticillata et Mucor circinelloides poss`edent un homologue de la prot´eine PTEN bien que j’ai pr´ec´edemment montr´e que les PI3K de classe I, qui catalysent la r´eaction inverse de PTEN, ont ´et´e perdues dans les lign´ees de Fungi. Si l’analyse phylog´en´etique approfondie des prot´eines PDPK1 et AKT1 r´ev`ele la pr´esence d’homologues dans ce groupe eucaryote, on pourra sup-poser que l’activation de l’autophagie chez les champignons s’effectue, comme chez l’Homme, `a travers la pr´esence dans le cytoplasme de PI(3,4,5)P₃; bien que ces derniers ne soient pas synth´etis´es grˆace aux prot´eines PI3K de la classe I.

Enfin, si le pipeline EPINe, dans sa version actuelle, permet l’inf´erence automa-tique des arbres de g`enes correspondants aux identifiants prot´eiques des compos´es d’une voie de signalisation d’int´erˆet, l’int´egration de donn´ees interactomiques d’es-p`eces mod`eles est encore en cours. L’utilisation de cet outil pour la d´ecouverte de nouvelles prot´eines impliqu´ees dans un processus pr´ecis est ´egalement envisag´ee et d´etaill´ee dans le chapitre6 de ce manuscrit.

6

C

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Conclusion générale

De la famille g´enique au r´eseau m´etabolique

Le th`eme central de ma th`ese ´etait l’´etude de l’´evolution des voies de signalisation au moyen des m´ethodes de phylog´enie mol´eculaire. Dans un premier temps, l’ana-lyse de la famille des PI3K m’a permis d’approfondir mes connaissances th´eoriques sur les m´ethodologies existantes. Bien que deux phylog´enies incompl`etes de cette famille aient ´et´e publi´ees avant ma th`ese, l’´etude pr´esent´ee dans ce manuscrit dresse un portrait plus d´etaill´e de leur histoire ´evolutive. Tout d’abord, j’ai montr´e que LECA poss´edait d´ej`a une sous-unit´e catalytique et une sous-unit´e r´egulatrice de la classe III, qui n’ont subi aucune duplication secondaire. Selon l’hypoth`ese admise, son g´enome codait ´egalement pour une ou deux prot´eines catalytiques de la classe I/II. Ensuite, de mani`ere surprenante, l’analyse a montr´e que les prot´eines r´ egula-trices de la classe I ont ´emerg´e beaucoup plus r´ecemment que les sous-unit´es cata-lytiques qu’elles r´egulent chez l’Homme. On peut donc se demander, par exemple, quel est le m´ecanisme de r´egulation de ces prot´eines catalytiques dans un groupe tel que les Amoebozoa, dont les g´enomes ne codent pour aucune prot´eines r´ egu-latrices de classe I. Pour finir, l’analyse phylog´en´etique pr´ecise de la classe I des PI3K coupl´ee `a l’´etude de leur composition en domaines sugg`ere que la duplication `

a l’origine des sous-classes IA et IB catalytiques s’est accompagn´ee d’un change-ment fonctionnel. Chez l’Homme, la sous-unit´e catalytique IB est en effet impliqu´ee dans la motilit´e de certaines cellules du syst`eme immunitaire tandis que les sous-unit´es IA sont impliqu´ees dans diff´erents autres processus. La copie pr´e-duplication pr´esente chez les Amoebozoa a, quant `a elle, ´et´e d´ecrite comme impliqu´ee dans la chimiotaxie de ces organismes dans de nombreuses ´etudes ind´ependantes. On peut

donc se demander si la duplication IA/IB survenue chez le dernier ancˆetre commun des MIC et le changement fonctionnel l’accompagnant n’est pas directement li´e au passage `a la multi-cellularit´e au sein des Opisthokonta.

Cette premi`ere ´etude phylog´en´etique a mis en ´evidence une probl´ematique sp´ e-cifique des jeux de donn´ees eucaryotes, `a savoir la gestion des transcrits alternatifs. D´etect´es lors de la phase de recherche de similarit´e de s´equences, une s´election de ces transcrits alternatifs doit ˆetre effectu´ee avant l’´etape d’inf´erence des arbres de g`enes. En effet, une seule s´equence prot´eique par locus g´enomique doit ˆetre conser-v´ee afin d’´eviter des biais lors de l’alignement multiple de s´equences ainsi qu’au moment de la s´election de blocs conserv´es. Pourtant, aucune m´ethodologie fond´ee sur des crit`eres de similarit´es de s´equences n’a encore ´et´e publi´ee pour r´epondre `a ce probl`eme. Dans ce contexte, j’ai d´evelopp´e BATfinder qui, bien qu’utilisant une m´ethodologie tr`es proche de celle de GUIDANCE, pr´esente un temps d’ex´ecution plus faible que ce dernier, notamment en mode parall`ele. Ce logiciel permet ´ ega-lement d’obtenir en moyenne de meilleurs arbres phylog´en´etiques que la s´election syst´ematique du transcrit alternatif le plus long.

Enfin, l’´etude de la voie AKT/mTOR, activ´ee par les PI3K, m’a donn´ee l’oc-casion de commencer le d´eveloppement d’EPINe, un pipeline automatique d´edi´e `

a l’´etude de la mise en place des r´eseaux m´etaboliques eucaryotes. En effet, grˆace `

a l’exp´erience acquise avec l’´etude des PI3K, j’ai pu mettre en place une chaˆıne de traitement qui, `a partir d’une liste d’identifiants UniProtKB, produit les arbres eucaryotes correspondants. Afin de faciliter leur interpr´etation par l’utilisateur, ces derniers sont annot´es (fonction biologique) et colori´es selon leur appartenance taxo-nomique. Bien que toujours en cours, l’´etude de cette voie m’a permis de montrer que les principales prot´eines de la voie AKT/mTOR telles que AKT, Beclin1 ou mTOR, ´etaient d´ej`a pr´esentes chez LECA. L’analyse des arbres phylog´en´etiques a ´egalement permis de mettre en ´evidence une expansion majeure qui a eu lieu avant le dernier ancˆetre commun des Metazoa.

Cependant, au del`a de l’´etude de l’histoire ´evolutive de chaque composant d’une voie de signalisation, c’est l’analyse coupl´ee de ces donn´ees phylog´en´etiques et de donn´ees interactomiques qui est pertinente pour l’´etude de la mise en place des voies de signalisations au cours de l’´Evolution. En effet, la plupart des prot´eines impliqu´ees dans un processus cellulaire exercent leur fonction en interagissant phy-siquement et directement avec d’autres prot´eines pr´esentes dans la cellule. Dans le cas de la voie AKT/mTOR, l’´etude pr´eliminaire des arbres inf´er´es conjointement

aux donn´ees issues des interactomes de l’Homme et de la levure a ainsi permis de mettre en ´evidence un certain degr´e de conservation des interactions, supposant une conservation de la fonction des homologues.

Perspectives d’EPINe

Si l’analyse des 62 arbres phylog´en´etiques de la voie de signalisation AKT/mTOR a ´et´e effectu´ee manuellement, l’objectif du pipeline EPINe est, `a terme, de g´erer automatiquement cette ´etape. Dans le cadre ce projet, les principales informations `

a extraire des arbres phylog´en´etiques sont : i) la date de l’´emergence de la prot´eine chez les Eucaryotes, ii) les ´ev´enements de duplication que le g`ene a subi, et iii) la liste des organismes ou lign´ees ayant perdu le g`ene.

Dans un premier temps, l’identification automatique des ´ev´enements ´evolutifs (duplications et pertes) subi par chaque g`ene sera inf´er´e `a l’aide de PhylDog [412], qui est un logiciel de r´econciliation d’arbres de g`enes et d’arbre d’esp`eces. Ainsi, cette ´etape implique de poss´eder un arbre d’esp`eces de r´ef´erence compos´es de l’en-semble des esp`eces eucaryotes pr´esentes dans mes banques de donn´ees (arbre pr´ e-sent´e dans l’annexeC.4). Dans un second temps, le logiciel TPMS [413] sera utilis´e afin de rechercher des motifs dans les arbres r´econcili´es et donc de dater les dupli-cations identifi´ees par PhylDog. Les quelques tests pr´eliminaires que j’ai effectu´es sur des prot´eines de la voie AKT/mTOR sont prometteurs et l’int´egration de ces deux logiciels dans EPINe devrait ˆetre effectu´e assez rapidement.

Par ailleurs, son principal objectif ´etant de combiner informations phylog´en´ e-tiques et interactomiques, il est n´ecessaire de proposer diff´erents interactomes d’or-ganismes mod`eles dans EPINe. Une perspective de ce travail est donc d’obtenir les interactomes complets du n´ematode, de la plante A. thaliana et si possible un in-teractome d’Excavata `a partir des donn´ees issues des bases publiques d’interactions prot´eine-prot´eine. Enfin, le couplage automatique de ces deux types d’informations sera effectu´e `a travers la visualisation de l’´evolution de la voie de signalisation avec le logiciel Cytoscape [410]. En effet ce logiciel permet, entre autres, de visualiser les graphes ainsi que de colorier automatiquement les nœuds (i.e. les prot´eines) et les arrˆetes (i.e. les interactions) en fonction d’un attribut donn´e (absence/pr´esence d’homologue dans le groupe consid´er´e, conservation de l’interaction, etc.). N´ ean-moins, la mise en place de cette approche est complexifi´ee par la n´ecessit´e de l’automatisation de la recherche de conservation d’interaction. En effet, elle im-plique de g´erer automatiquement les pertes ´eventuelles d’interacteurs ainsi que

les duplications ayant eu lieu depuis la divergence des deux organismes mod`eles. L’impl´ementation de cette ´etape d´epend donc de l’´etape pr´ec´edente permettant de d´etecter automatiquement ces ´ev´enements ´evolutifs.

Enfin, un dernier objectif du projet EPINe est l’identification de nouvelles pro-t´eines potentiellement impliqu´ees dans la voie de signalisation ´etudi´ee mais non d´ecrites comme tel dans la litt´erature. Pour ce faire, un algorithme de clustering sera tout d’abord utilis´e sur les interactomes des organismes mod`eles afin de mettre en ´evidence des sous-r´eseaux de prot´eines fortement connect´ees. Dans un second temps, les sous-r´eseaux dont une portion significative des nœuds sont des prot´eines de la voie d’int´erˆet seront retenus. En effet, puisqu’en interaction avec ces derni`eres,