La PDE10 des spermatozoïdes humains n'est pas palmitoylée

Après avoir soumis des spermatozoïdes au protocole ABE modifié, en parallèle avec un échantillon de striatum murin, les protéines palmitoylées ont été séparées sur gel SDS-PAGE, et le western blot obtenu a été incubé avec un anticorps anti-PDE10 (Figure 4-7). Si on observe bien une bande au poids attendu pour PDE10 dans la piste correspondant aus protéines de striatum en présence d’hydroxylamine (HAM), rien n’est observé pour les spermatozoïdes humains, même en présence de HAM.

94 Figure 4-7 : Palmitoylation de PDE10.

Les spermatozoïdes et le striatum de souris (contrôle positif) ont été solubilisés puis les protéines ont été précipitées. La palmitoylation des protéines a été détectée par le protocole ABE modifié. Les protéines palmitoylées ont été purifiées et séparées sur gel SDS-PAGE. La présence de PDE parmi elles a été détectée par Western blot avec un anticorps monoclonal anti-PDE10. (N=2).

"-" : contrôle interne, absence de HAM ; "+" : essai en présence de HAM.

4.4 Discussion

L'isoforme de PDE10 retrouvée dans le spermatozoïde humain éjaculé et caractérisée par immunoprécipitation et spectrométrie de masse correspond à l'isoforme PDE10X4 selon la nomenclature actuelle sur le site NCBI (NCBI 2016b). Il s'agit de l'isoforme la plus proche de celle retrouvée dans le spermatozoïde bovin (Figure 4-1), avec une homologie de 95% entre les deux séquences. Lorsqu’on aligne les séquences de PDE10X4 humain et PDE10X4 bovin, on se rend compte que seules une très petite partie à l'extrémité N-terminale, et une petite partie en C-terminal diffèrent. Il est intéressant de voir que cette PDE spermatique semble conservée entre deux espèces de mammifères dont la physiologie spermatique est proche. Cela permet aussi de confirmer le l’importance de cette protéine dans la physiologie spermatique.

La PDE10 retrouvée dans le spermatozoïde humain semble située dans un compartiment cytosolique. Contrairement à ce que l'on a vu chez le bovin, on n'observe aucun signal dans le compartiment membranaire. Cependant, il faut préciser que la fragmentation chez l'humain

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n'a été réalisée qu'une seule fois, donc l'information reste sujette à caution. Pour des raisons encore incomprises, aucune immunolocalisation n'a pu être correctement réalisée avec des spermatozoïdes humains et ce malgré plusieurs essais avec différentes techniques de fixation, perméabilisation et anticorps différents. Nous ne pouvons donc pas déterminer sa localisation dans le spermatozoïde pour le moment.

PDE10 semble avoir un impact clair sur la phosphorylation en tyrosine car on observe une augmentation de la phosphorylation sur tyrosine lorsque PDE10 est inhibée. Par contre, même si une tendance semble exister, aucune différence significative n'a été observée pour ce qui est de la phosphorylation par PKA. La situation est différente de ce que l'on observe chez le bovin où l'inhibition de PDE10 ne semblait pas avoir d'impact sur la phosphorylation par PKA ou sur les résidus tyrosine. Aucune tendance ne semblait même se détacher. Cela est assez curieux car la phosphorylation par PKA et celle sur résidus tyrosine semblent être un marqueur essentiel de la capacitation et une étape très importante de la physiologie spermatique. Il est donc étonnant que l'on montre chez l'humain un impact de PDE10 qui n'existe pas chez le bovin. Il faut tout de même préciser que les profils de phosphorylation sur tyrosine sont bien mieux caractérisés chez l'humain que chez le bovin (Sepideh et al. 2009; Sati et al. 2014). Dans tous les cas, cela montre un impact important de PDE10 sur la capacitation humaine pour la semence fraîche. Pour ce qui est de la palmitoylation, tout comme chez le bovin, les résultats supportent une absence chez la PDE10 humaine spermatique.

Pour conclure sur ce court chapitre, l'étude de la situation de la PDE10 spermatique humaine a permis de conforter certains résultats obtenus chez le bovin, comme la nature de l'isoforme retrouvée, sa localisation ainsi que son absence de régulation par palmitoylation, qui sont des aspects assez capitaux de l'identité et de la régulation de PDE10 spermatique. En revanche, l'impact de PDE10 sur la phosphorylation sur tyrosine observé chez l'humain et non chez le bovin est une découverte surprenante, mais qui peut être expliquée en partie par la différence de qualité de semence des deux espèces étudiées. Il serait maintenant souhaitable de mesurer l'impact de PDE10 sur la motilité des spermatozoïdes humains. Cela a été notamment fait en partie par l'équipe du Dr Barratt (Tardif et al. 2014), mais avec un inhibiteur de PDE10 peu spécifique, et utilisé à des doses que nous jugeons trop élevées. Enfin, il faudrait réaliser des immunofluorescences pour mieux localiser la protéine, même si nous supposons qu'elle se retrouvera dans le compartiment acrosomal, comme l'isoforme bovine.

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5. Chapitre 5 : Discussion générale

Ce mémoire a permis de faire avancer les connaissances sur une des phosphodiestérases les plus récemment découverte, la PDE10. Issue d'un gène unique, elle se décline en plusieurs variants d'épissage. Essentiellement présente dans le cerveau où elle a beaucoup été étudiée, on sait maintenant qu'elle est exprimée dans les spermatozoïdes éjaculés bovins et humains. Chez le bovin, on caractérise l'isoforme X4 dans le spermatozoïde bovin éjaculé. Si on a également retrouvé le variant d'épissage X3, codant pour l'isoforme protéique X2, cette dernière n'a pour l'instant pas été montrée dans le spermatozoïde. La protéine PDE10X4 est majoritairement cytosolique, présente dans la région acrosomale et associée à celle-ci. Un doute subsiste toujours quant à l'existence d'une population membranaire, il se pourrait que celle-ci soit artéfactuelle. Il est possible cependant que PDE10 soit localisée proche des membranes par une association à des complexes protéiques de haut poids moléculaire. Cela va dans le même sens que l'idée émergente d'une régulation très locale de l'AMPc propagée par des articles comme (Buffone et al. 2014). Cependant, l'attachement de PDE10 aux membranes acrosomales n'est pas exclu.

Pour ce qui est de la régulation de la localisation et de l’activité de PDE10, peu d'avancements ont été apportés : aucune phosphorylation par PKA n'a été montrée, ni de palmitoylation. Ceci contraste avec la situation retrouvée dans le striatum, où la localisation et la fonction de PDE10 est régulée par la phosphorylation par PKA de la thréonine 16 et la palmitoylation de la cystéine 2. Il faut cependant rappeler que le contexte cellulaire n'est pas du tout le même, et que les isoformes retrouvées dans les deux types cellulaires sont différentes. D’après (Russwurm et al. 2015), l’activité de PDE10 dans le striatum n’est pas modifiée par sa palmitoylation ou la phosphorylation par PKA. Cependant, ils s’accordent avec (Charych et al. 2010) sur le fait que l’augmentation de la concentration en AMPc entraine un décrochement de PDE10 qui peut ensuite aller dégrader le nucléotide cyclique. Ainsi, PDE10 serait régulée par son appartenance à des complexes protéiques.

Contrairement à notre hypothèse de départ, il semblerait que l'activité de PDE10 ne diminue pas lors de la capacitation, mais resterait inchangée. Il faudrait modifier le protocole utilisé pour permettre une plus grande assurance des quantités de PDE10 déposées dans chaque tube d’essai, mais surtout, contourner la compétition qui existe actuellement entre l’anticorps utilisé, clone 1C9, et la liaison de l’AMPc sur le domaine GAF B de PDE10 suite à l’augmentation des concentrations d’AMPc conséquentes de la capacitation. Cela nécessiterait premièrement l’utilisation d’un anticorps avec un épitope différent du clone 1C9. L’épitope de cet anticorps n’était pas connu lors de l’achat, et a été découvert de manière fortuite, assez tard au cours des expérimentations. Il serait intéressant de voir si une corrélation existe entre la localisation de PDE10 dans les complexes protéiques potentiels et l'activité enzymatique.

En accord avec notre hypothèse de départ, mais de manière assez curieuse, j’ai montré que PDE10 semble bien jouer un rôle dans la motilité spermatique, mais uniquement sur des spermatozoïdes cryoconservés. Cependant, on s'attendait à observer une augmentation de la

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motilité spermatique en réponse à l'inhibition de PDE10, mais le contraire est cependant observé. Il est connu que la cryoconservation des spermatozoïdes avait tendance à déclencher leur réaction d’acrosome de manière précoce. Dans ce mémoire, on montre que PDE10 semble avoir un rôle d’inhibiteur de la réaction acrosomale. On sait également que les spermatozoïdes à l’acrosome réagit sont motiles durant peu de temps. Ainsi, on comprend que la motilité des spermatozoïdes cryoconservés peut être beaucoup plus impactée par l’inhibition de PDE10 que celle des spermatozoïdes fraîchement éjaculés.

Quoi qu'il en soit, il faudrait continuer à explorer cette voie pour comprendre quels sont les effecteurs possibles de PDE10, protéine située dans la région acrosomale du spermatozoïde, et la motilité, composante flagellaire.

En revanche, le résultat le plus intéressant se trouve être celui que l’on n’avait pas prévu au départ : le rôle de la PDE10 sur la réaction acrosomale. Il semblerait en effet que la protéine soit un frein au déclenchement de la réaction d'acrosome. La réaction d’acrosome étant en partie déclenchée par de fortes concentrations d’AMPc, il est probable que PDE10 contrôle les concentrations pour empêcher un déclenchement trop précoce de la cascade menant à l’exocytose acrosomale (voir partie 1.4). Il faudrait cependant exploiter cette voie plus en profondeur pour en comprendre les tenants et les aboutissants, et notamment, comment PDE10 est régulée pendant la réaction d’acrosome Cette fonction putative de PDE10 semble tout de même la plus prometteuse, lorsque l'on sait à quel point le contrôle de la réaction d'acrosome est crucial pour la fertilité des spermatozoïdes.

Dans le spermatozoïde humain, on a caractérisé une isoforme de PDE très homologue de l'isoforme retrouvée dans le spermatozoïde bovin. De la même manière, la protéine semble cytosolique, même si d'autres expériences sont nécessaires pour le démontrer. L'isoforme retrouvée ne semble pas palmitoylée, de la même manière que ce qui a été observé chez le bovin. D’ailleurs, aucun site de palmitoylation à l’extrémité N-terminale de la protéine n’est prédit par le logiciel de prédiction de sites de palmitoylation CSS-Palm, que ce soit chez l’humain ou le bovin.

Une différence majeure observée entre les PDE10 humaine et bovine, est leur impact sur la phosphorylation sur résidus tyrosine. Alors que l'on ne l'observe pas du tout chez le bovin, on la montre nettement chez l'humain. C'est une situation assez curieuse, mais on sait que les profils de phosphorylation sont bien mieux caractérisés chez l'humain que chez le bovin. Pour terminer, les résultats obtenus au cours de ces deux ans sont un premier pas vers la compréhension du rôle de PDE10 dans la physiologie spermatique. Ce travail a pu montrer que l’isoforme X4 de PDE10 était présente dans le compartiment acrosomal du spermatozoïde bovin, et qu’une isoforme très homologue était présente dans le spermatozoïde humain. La protéine ne semble pas régulée par palmitoylation, contrairement à son homologue striatale. Il se pourrait cependant que la PDE10 spermatique fasse partie de complexes protéiques de haut poids moléculaire, même si cette appartenance est régulée par des mécanismes inconnus pour le moment. Si l’inhibition de PDE10 semble entraver fortement les paramètres de motilité spermatique, il se pourrait que cela soit dû à une

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amplification de l’exocytose acrosomale due à la cryoconservation. En effet, il a été montré que PDE10 inhibe le déclenchement de la réaction d’acrosome. Au vu de la localisation acrosomale de cet enzyme catalysant les nucléotides cycliques, il se pourrait que PDE10 agisse en contrôlant les concentrations d’AMPc dans le compartiment acrosomal, mais des investigations supplémentaires sont nécessaires.

Il serait maintenant intéressant de confirmer l’appartenance de PDE10 à des complexes de haut poids moléculaire, et d’en déterminer les membres, ainsi que de comprendre les mécanismes qui régulent cette liaison. En modifiant le protocole de mesure de l’activité enzymatique, il serait sûrement possible d’avoir une idée plus claire de la variation d’activité de PDE10 avant et après la capacitation, ce qui renseignerait davantage sur son rôle. Il faudrait aussi comprendre plus précisément le rôle de PDE10 dans le contrôle du déclenchement de l’exocytose acrosomale, ainsi que le découvrir le déroulement précis de son action. Cette voie semble en effet d’un intérêt majeur pour l’étude de sérieux problèmes d’infertilité.

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