transplantations d'organe 3.1 Les antigènes HLA
3) la période post-transplantation chez un patient non immunisé.
La synthèse de novo d’anticorps dirigés contre le greffon correspond à une réponse humorale primaire et survient en général plus tardivement. En effet, la réponse primaire est en général bloquée par le traitement immunosuppresseur fort anti-lymphocytaire T des premières semaines ou des premiers mois. Cette synthèse de novo se fait volontiers plus tardivement lorsque le traitement est volontairement diminué en raison d'une complication ou lorsque le patient devient moins bien observant. Là encore, la mise en place d’une réponse humorale primaire nécessite une collaboration T-B efficace et c’est probablement la levée de l’immunosuppression T avec une fonction B relativement préservée par les régimes immunosuppresseurs actuels qui favorise cette réaction.
5.2
Détection des lymphocytes B mémoire et des plasmocytes alloréactifs
Les quelques travaux qui à ce jour ont cherché à étudier le rôle des différentes sous- populations lymphocytaires B dans la synthèse des anticorps anti-HLA se sont d'abord appliqués à les mettre en évidence chez des sujets immunisés. Quelques groupes se sont employés à détecter la présence de lymphocytes B mémoire alloréactifs et essentiellement une étude a porté spécifiquement sur les plasmocytes alloréactifs.
Détection des lymphocytes B alloréactifs circulants
La mise en évidence des lymphocytes B mémoire alloréactifs circulants se base sur deux types d'observations :
1) le marquage de l'immunoglobuline de surface par des tétramères de molécules HLA permettant ainsi de mettre en évidence la spécificité vis-à-vis d'un antigène HLA donné ;
2) la propriété des lymphocytes B mémoire de se différencier in vitro en plasmocytes seulement sous l'effet d'une stimulation polyclonale indépendante de l'antigène (cf chapitre 3.2) qui peut combiner des agonistes des TLR (« Toll-like recepteurs »), des cytokines T, et un signal CD40-Ligand. Cette propriété les distingue des lymphocytes B naïfs qui nécessitent, pour se différencier en plasmocytes, un signal BCR fort, une activation par les lymphocytes T auxiliaires et un 3ème signal qui peut être délivré par un agoniste des TLR ou des cytokines produites par les cellules dendritiques (194).
Mulder et coll. ont été les premiers à isoler à l’aide de tétramères de la molécule HLA A2 les lymphocytes B de femmes immunisées après grossesse et porteuses d’anticorps sériques anti- A2 (195). La proportion de lymphocytes B marqués par les tétramères était de 0,11% ce qui donne une idée de la fréquence des lymphocytes B spécifiques d’un alloantigène donné. Cette fréquence semble plus réaliste que celle qui a été retrouvée dans l’étude de Zachary et coll., portant sur 66 patients en attente de transplantation, où 4 à 5 % des cellules CD19+ étaient marquées par un des différents tétramères testés (196,197). Dans ces deux études, les lymphocytes B allospécifiques fixant les tétramères par leur immunoglobuline de surface étaient sélectionnés positivement, et leur différenciation en plasmocytes était effectuée in
vitro à l’aide d’une coculture avec la lignée EL4.B5 exprimant le CD40-ligand humain et d'un
surnageant de culture T. Des IgG et des IgM spécifiques du tétramère – donc anti-A2 – ont bien été retrouvées dans le surnageant de culture à J9 et J16 de culture (195) mais aussi d’autres anticorps réagissant ou non de façon croisée avec la spécificité portée par le tétramère (196).
Dans une étude analogue, Han et coll. ont séparé chez des patients immunisés les lymphocytes B mémoire CD27+ et les lymphocytes B naïfs CD27- avant de les mettre en co-
culture avec la même lignée CD40L+ EL4.B5 et un surnageant de culture T (198). Le surnageant de culture était analysé par Luminex®. Au total, 13 des 16 patients transplantés avaient des anticorps dans leur surnageant. Ces 13 patients avaient au total 50 DSA détectables dans le sérum ou le surnageant, parmi lesquels 35 étaient détectés à la fois dans le sérum et le surnageant, 11 uniquement dans le sérum, et 4 uniquement dans le surnageant. L’hypothèse des auteurs est que ces derniers anticorps traduisent probablement la présence de lymphocytes B mémoire à un très faible niveau ce qui explique leur absence de détection dans le sérum.
Ces trois études montrent qu’il est possible d’isoler chez des sujets immunisés des lymphocytes B circulants mémoire capables de se différencier in vitro en plasmocytes sécrétant des alloanticorps sous l’effet d’une stimulation polyclonale.
64 L'équipe de Leiden a récemment mis au point une technique d'ELISPOT B permettant de déterminer précisément la fréquence de ces lymphocytes B mémoire alloréactifs (199). Le principe repose toujours sur la différenciation in vitro des lymphocytes B mémoire en plasmocytes sous l'effet d'une stimulation polyclonale. Au bout de 6 jours de culture, les plasmocytes sont transférés dans une plaque d'ELISPOT dont les puits ont été recouverts avec des monomères d'une molécule HLA donnée. Après 20 heures de mise en contact, la fixation des anticorps spécifiques sur la plaque est révélée par une technique colorimétrique sous la forme de spots dont chacun correspond à la présence d'un plasmablaste. La fréquence des lymphocytes B mémoire spécifiques est ainsi déterminée en faisant le rapport du nombre de spots spécifiques avec le nombre de spots correspondant aux IgG totales déterminé en parallèle avec les cellules du même donneur. Cette fréquence est en moyenne de 45/106 lymphocytes B totaux [0-182] pour les femmes immunisées à la suite d'une grossesse. Cette fréquence est plus faible globalement chez les patients immunisés à la suite d'une transplantation, 20/106 lymphocytes B totaux [1-143] mais 8 patients sur 10 ont moins de 10 cellules/106 lymphocytes B. Même si cette technique d'ELISPOT doit être affinée, avec notamment la détermination d'un seuil de positivité, elle reste sûrement la technique de quantification la plus fiable à l'heure actuelle, le marquage en cytométrie à l'aide de tétramères fluorescents étant une technique difficile, du fait de la faible fréquence des lymphocytes B mémoire et de l'absence de recours à une étape d'amplification in vitro.
Détection des plasmocytes médullaires alloréactifs
Le rôle des plasmocytes médullaires a été abordé par une étude issue de la Mayo Clinic (200). L'étude a comporté une ponction médullaire avec aspiration et mise en culture des plasmocytes sélectionnés positivement à l'aide de billes CD138+ chez 9 patients immunisés avant l’administration de tout traitement immunosuppresseur. Après une culture de trois jours, un ELISPOT a été réalisé en mettant en contact ces plasmocytes avec des antigènes HLA correspondant à des spécificités présentes dans le sérum. Une analyse des surnageants de culture a été réalisée par Luminex®. La fréquence dans la moelle osseuse des plasmocytes spécifiques d'un antigène HLA donné était de 1/2.106 plasmocytes (CD138+, Ig cytoplasmique+). Le profil des anticorps dans le surnageant de culture des plasmocytes était analysé par Luminex® et comparé à celui du sérum. Toutes les spécificités des anticorps anti- HLA détectés dans le sérum étaient retrouvées dans le surnageant de culture. Il existait cependant une faible corrélation entre le titre des alloanticorps sériques et la fréquence des
plasmocytes déterminée par ELISPOT. A l'opposé, il existait une assez bonne corrélation entre les anticorps sériques et les anticorps du surnageant de culture des plasmocytes : 80% des spécificités du sérum ayant un titre normalisé en cytométrie >1000 (titre fort correspondant à un cross match en cytométrie positif) avaient également un titre élevé dans le surnageant.
En résumé, ces études montrent qu'il est possible d'isoler chez des patients immunisés vis-à- vis d'antigènes HLA à la fois des lymphocytes B mémoire circulants et des plasmocytes médullaires. Elles ne mettent cependant pas directement en évidence le rôle respectif de ces deux populations cellulaires dans la synthèse des anticorps anti-HLA.