La glucose-6-phosphatase

La G6Pase est l’enzyme clé de la production endogène de glucose car elle catalyse la dernière étape commune à la glycogénolyse et à la néoglucogenèse. Cette réaction enzymatique précède la libération du glucose dans la circulation sanguine et confère ainsi à la G6Pase une position stratégique dans la régulation de l’homéostasie glucidique.

La G6Pase est un complexe enzymatique situé dans la membrane du réticulum endoplasmique. Elle est constituée de deux sous-unités : une sous-unité transportant le glucose-6-phosphate du cytoplasme à la lumière du réticulum endoplasmique (G6PT) et une sous-unité catalytique (G6PC) qui transforme le G6P en glucose et phosphate inorganique

(Figure 9). Alors que l’expression de la G6PT est ubiquitaire, celle de la G6PC est restreinte

au foie, aux reins et à l’intestin. Dans l’intestin, la G6Pase est exprimée selon un gradient décroissant du duodénum à l’iléon (Rajas et al., 1999). Une étude par immunohistochimie de notre laboratoire a permis de préciser la localisation cellulaire de la G6Pase. Attestant d’une activité néoglucogénique dans ces tissus, la G6Pase est co-localisée avec la PEPCK dans les hépatocytes périportaux, les tubules proximaux du cortex rénal et le sommet des villosités

43 intestinales. D’une manière surprenante, la G6Pase est également localisée dans des tissus n’exprimant pas la PEPCK tels que les canaux biliaires intra-hépatiques, les cryptes des villosités intestinales, l’épithélium urinaire des tubules collecteurs et les calices rénaux (Rajas et al., 2007). Dans ces tissus, il a été récemment suggéré que la G6Pase pourrait être impliquée dans le transport de glucose et constituer une voie alternative d’absorption trans- épithéliale de glucose n’impliquant pas le transporteur GLUT2 (Stümpel et al., 2001).

4. Les effets différentiels de la production hépatique et de la

production intestinale de glucose

Depuis de nombreuses années notre laboratoire s’intéresse au rôle spécifique de la production de glucose par chacun des organes néoglucogéniques dans le contrôle de l’homéostasie énergétique et glucidique. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un nouveau concept selon lequel l’augmentation de la production hépatique de glucose aurait des effets « délétères » sur l’organisme (augmentation de la glycémie et insulinorésistance), alors qu’au contraire l’augmentation de la production intestinale de glucose aurait des effets bénéfiques.

a. Effets délétères de l’augmentation de la production hépatique de glucose

Des études ont démontré que les patients diabétiques de type II présentaient une augmentation de leur production hépatique (PHG) de glucose qui semble être responsable de leur hyperglycémie à jeun (Gerich, 1991; Magnusson et al., 1992). D’un point de vue moléculaire, cette augmentation de la PHG est corrélée à une augmentation de l’activité de la G6Pase hépatique (Clore et al., 2000). Des études chez des modèles murins ont permis de clarifier le rôle de la PHG dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. En effet, une étude réalisée chez le rat a permis de mettre en évidence que la simple surexpression hépatique de la G6Pase était suffisante pour induire des altérations métaboliques comparables à celles observées lors d’un état pré-diabétique (Trinh et al., 1998). De plus, la surexpression hépatique du gène Pepck entraîne une augmentation de la production hépatique de glucose et conduit au développement d’une insulinorésistance chez la souris (Sun et al., 2002). A l’inverse, différentes études ont montré que la diminution de la PHG induisait des effets

Figure 10 : Effets bénéfiques de l’augmentation de la néoglucogenèse

intestinale

L’induction de la néoglucogenèse intestinale va induire la libération de glucose dans la veine porte. Ce glucose va être détecté par des capteurs portaux qui vont transmettre un signal nerveux (« signal glucose portal ») au cerveau et mener à l’activation de zones cérébrales cibles et ainsi induire des effets bénéfiques.

(D’après Delaere et al., 2012, 2013 ; Pillot et al., 2009 et De Vadder et al., 2014)

Détection du glucose par des capteurs

portaux Déte Déte 3 Induction d’effets bénéfiques Indu I d 6 Activation de zones cérébrales cibles Acti Act 5 Transmission nerveuse du « signal glucose portale » T 4 Libération de glucose dans la veine porte Libé Lib 2 _{néoglucogenèse} Induction de la intestinale Ind Ind 1 - Diminution de la PHG - Augmentation de l’insulino-sensibilité Induction de la satiété

44 bénéfiques sur l’homéostasie glucidique. Tout d’abord, Sloop et al. ont montré que l’inhibition de l’expression de la G6PT dans le foie via des oligonucléotides antisens entraînait une diminution de la glycémie proportionnelle à la diminution de l’activité de la G6Pase hépatique chez des souris génétiquement obèses et diabétiques (ob/ob) (Sloop et al., 2007). Ensuite, il a été démontré que l’inhibition de la PEPCK hépatique dans un modèle de souris obèse et diabétique (db/db) entraînait une diminution de la production hépatique de glucose et une amélioration des paramètres glucidiques (Gómez-Valadés et al., 2008). Enfin, notre laboratoire a récemment montré que les souris invalidées pour le gène G6pc spécifiquement dans le foie présentaient une augmentation de l’utilisation périphérique de glucose et de l’oxydation musculaire des lipides. Ces souris résistent ainsi au développement de l’obésité et du diabète sous régime hypercalorique (Abdul-Wahed et al., 2014). Ces données démontrent donc bien le rôle causal de l’augmentation de la production hépatique de glucose dans le développement de l’insulinorésistance et du diabète de type II.

b. Effets bénéfiques de l’augmentation de la production intestinale de glucose

Notre laboratoire a maintenant clairement établi que l’augmentation de la production intestinale de glucose (PIG) induisait des effets bénéfiques sur le métabolisme glucidique et énergétique. Le glucose est libéré par l’intestin dans la veine porte où il est détecté par des capteurs portaux qui vont transmettre l’information au cerveau via des afférences nerveuses. Ceci va aboutir non seulement à l’activation des aires cérébrales impliquées dans la satiété et la préférence alimentaire (Delaere et al., 2012, 2013) mais va aussi activer un arc réflexe central responsable d’une augmentation de la sensibilité périphérique à l’insuline et d’une diminution de la production hépatique de glucose (Pillot et al., 2009; De Vadder et al., 2014) (Figure 10). Au cours des 10 dernières années, notre laboratoire a démontré le rôle causal et bénéfique de l’augmentation de la PIG dans différentes situations.

i. Effets des régimes enrichis en protéines et rôle des récepteurs mu- opioïdes

Les régimes hyperprotéiques sont connus pour induire des effets bénéfiques tels que des phénomènes de satiété (Veldhorst et al., 2008; Weigle et al., 2005) ou des améliorations de l’homéostasie glucidique (Gannon et al., 2003; Nuttall et al., 1985). Nous avons démontré

Augmentation

de la NGI

Arrivée des protéines alimentaires Arri Arr 1 Inhibition des récepteurs mu- opioïdes Inh In 3 Arc réflexe Arc A 6 Activation de zones cérébrales Act A 5 Transmission d’un signal nerveux Tran Tra 4 Libération d’oligopeptides LL 2

Figure 11 : mécanismes d’induction de la néoglucogenèse intestinale par les

protéines alimentaires

Les protéines de l’alimentation sont digérées dans le tractus digestif ce qui permet la libération d’oligopeptides au niveau de la veine porte. Ces oligopeptides vont inhiber les récepteurs mu-opioïdes périportaux ce qui va induire un arc réflexe central aboutissant à l’induction de la néoglucogenèse intestinale (NGI).

45 que les effets bénéfiques des protéines étaient dépendants d’une augmentation de la PIG. En effet, les régimes enrichis en protéines induisent chez le rat une diminution de la prise alimentaire reliée à une forte induction des gènes de la néoglucogenèse intestinale (NGI) (Mithieux et al., 2005). De plus, les souris invalidées pour le gène G6pc spécifiquement dans l’intestin (I-G6pc-/-) sont insensibles à l’effet anorexigène des protéines (Penhoat et al., 2011), ce qui prouve bien le rôle causal de la NGI dans les effets bénéfiques des protéines.

D’un point de vue mécanistique, nous avons établi que cet effet des protéines dépendait d’une inhibition des récepteurs mu-opioïdes localisés au niveau des fibres nerveuses entourant la veine porte (Duraffourd et al., 2012). En effet, les récepteurs mu-opioïdes, bien qu’étant très connus pour leur rôle dans la réponse à la douleur, jouent également un rôle important dans le système de récompense et dans la modulation de la prise alimentaire et de la préférence alimentaire. Ainsi, l’administration d’agonistes mu-opioïdes augmente la prise alimentaire tandis que l’administration d’antagonistes mu-opioïdes la diminue (Nogueiras et al., 2012). De plus, certaines protéines de l’alimentation sont connues pour libérer des peptides à activité mu-opioïde lorsqu’elles sont digérées (Zioudrou et al., 1979). Ces données nous ont amenés à penser que l’effet anorexigène des régimes enrichis en protéines passait par une inhibition des récepteurs mu-opioïdes. Nous avons ainsi réalisé des perfusions de di- et tri-peptides ainsi que d’oligopeptides dans la veine porte de rongeurs et montré que ces peptides inhibaient les récepteurs mu-opioïdes péri-portaux. Cette inhibition conduit alors à la transmission d’un signal au cerveau via les afférences vagales et spinales qui, en retour, va induire la NGI. Cette augmentation de la production intestinale de glucose va ensuite induire ses effets bénéfiques, à savoir une induction de la satiété et une amélioration de la sensibilité hépatique à l’insuline (Duraffourd et al., 2012; Pillot et al., 2009) (Figure 11). Le rôle causal des récepteurs mu-opioïdes a été démontré à l’aide de souris invalidées pour le récepteur mu-opioïde (souris MOR-/-) qui présentent une insensibilité à l’effet coupe-faim des régimes hyper-protéinés. Ces souris ne présentent pas non plus d’augmentation de leur activité G6Pase intestinale en réponse à une perfusion de peptides (Duraffourd et al., 2012), ce qui montre bien que l’inhibition des récepteurs mu- opioïdes par les peptides est un prérequis à l’induction de la NGI et donc aux effets bénéfiques des protéines.

Figure 12 : Augmentation de la néoglucogenèse intestinale dans le cadre

d’une chirurgie de l’obésité, l’entéro-gastro-anastomose (EGA)

Représentation de l’EGA, une chirurgie qui consiste à créer une anastomose entre le jéjunum et l’estomac et à ligaturer le pylore afin d’éviter le passage des aliments dans le duodénum. L’activité de la glucose-6-phospatase (G6Pase) est fortement augmentée après EGA dans l’anse intestinale où circulent les aliments par rapport aux souris témoins non-opérées (contrôles), aux souris témoins opérées soumises à une restriction alimentaire (contrôles opérées) et aux souris avec un anneau gastrique (Anneau gastrique).

(D’après Troy et al., 2008)

Augmentation de la

néoglucogenèse intestinale

Contrôles EGA Contrôles

opérées

Anneau gastrique

Contrôles EGA Contrôles

opérées Anneau gastrique Act ivit é G6P as e (μ mol/min/ g)

46 ii. Effets des régimes riches en fibres

Récemment, nous avons rapporté le rôle causal de l’augmentation de la PIG dans les effets bénéfiques des régimes riches en fibres (De Vadder et al., 2014). En effet, la fermentation des fibres solubles par le microbiote intestinal produit des acides gras à chaînes courtes tels que le butyrate et le propionate, qui induisent directement ou indirectement la NGI. Cette augmentation de la NGI va alors mener à des effets bénéfiques sur le métabolisme énergétique en diminuant l’adiposité et sur le métabolisme glucidique en diminuant la production hépatique de glucose. Les souris invalidées pour le gène G6pc spécifiquement dans l’intestin sont insensibles aux effets bénéfiques des fibres alimentaires, démontrant le rôle causal de la PIG dans ces effets.

c. Production endogène de glucose et chirurgie bariatrique

Après by-pass gastrique, la production endogène de glucose est diminuée chez les patients obèses et diabétiques (Immonen et al., 2014; de Weijer et al., 2013). La contribution des organes glucoformateurs à la PEG semble également redistribuée avec une balance en faveur d’une diminution de la production hépatique de glucose et d’une augmentation de la production intestinale.

Des études chez l’homme et le rat montrent que la sensibilité hépatique à l’insuline est améliorée après BPG (Immonen et al., 2014; Paranjape et al., 2013). Chez le rat, une diminution de l’expression génique et protéique de la G6Pase hépatique est observée après by-pass duodéno-jéjunal (Kim et al., 2014; Sun et al., 2013). Cette diminution est accompagnée d’une augmentation de l’expression génique et protéique de la G6Pase intestinale dans les anses alimentaire et commune (Kim et al., 2014; Sun et al., 2013). Enfin, les effets de l’entéro-gastro-anastomose (EGA – Figure 12), une chirurgie assez différente de BPG mais plus facile à réaliser, ont été étudiés chez la souris (Troy et al., 2008). Les résultats montrent que l’EGA provoque une diminution de la prise alimentaire et du poids ainsi qu’une amélioration importante des paramètres glucidiques. Cette chirurgie engendre également une diminution la production endogène de glucose et une augmentation de l’activité de la G6Pase intestinale dans la partie de l’intestin où circulent les aliments, augmentation qui n’est pas retrouvée après anneau gastrique (Figure 12). De plus, les effets bénéfiques de cette chirurgie sur le métabolisme glucidique et la prise alimentaire sont

47 annulés chez les souris ayant subi une dénervation spécifique des fibres sensitives de la veine porte. Ces données suggèrent donc un rôle causal de la production intestinale de glucose dans les effets de cette chirurgie sur l’amélioration du contrôle glucidique et les sensations de satiété. Cependant, les mécanismes responsables de cette augmentation de la NGI après EGA n’ont pas encore été élucidés et aucun lien causal direct n’a encore été établi entre PIG et effets bénéfiques du BPG. Il est toutefois important de rappeler qu’une diminution de la production hépatique de glucose associée à une augmentation de la production intestinale de glucose pourraient toutes deux rendre compte, au moins en partie, des effets bénéfiques précoces des chirurgies bariatriques comme le BPG sur le métabolisme glucidique.

48

DEMARCHE EXPERIMENTALE

49 Les données de la littérature rapportées dans l’introduction de ce manuscrit montrent que les chirurgies de l’obésité, et plus particulièrement le by-pass gastrique Roux- en-Y (BPG), sont le traitement le plus efficace du diabète de type II. Chez les patients obèses et diabétiques, le BPG entraîne effectivement une forte perte de poids qui est maintenue à long terme (Sjöström, 2013) mais également des améliorations spectaculaires et très rapides du métabolisme glucidique indépendamment de la perte de poids (Pories et al., 1995; Wickremesekera et al., 2005). Bien que de nombreuses hypothèses aient été proposées, les mécanismes par lesquels le BPG induit de tels effets sur le métabolisme énergétique et glucidique ne sont pas encore clairement identifiés (cf. § III).

Grâce aux études menées au cours de ces dix dernières années, notre laboratoire a pu proposer un nouveau rôle de la production endogène de glucose dans la régulation du métabolisme glucidique et énergétique. En effet, les productions hépatique et intestinale de glucose lorsqu’elles sont augmentées provoquent des effets différents sur l’organisme. L’augmentation de la production hépatique de glucose est délétère pour l’organisme, entraînant une insulinorésistance et le développement du diabète de type II, alors que l’augmentation de la production intestinale de glucose a des effets bénéfiques sur la sensibilité à l’insuline et la prise alimentaire (cf. § IV.4).

L’une des hypothèses attractives pour expliquer les effets bénéfiques du BPG est que la production intestinale de glucose (PIG) serait augmentée après ce type de chirurgie et induirait alors ses effets bénéfiques sur le métabolisme glucidique et énergétique. En effet, grâce à un travail collaboratif, nous avions fortement suggéré à partir d’un modèle de by- pass intestinal (l’entéro-gastro-anastomose) qu’une augmentation de la PIG était à l’origine des effets bénéfiques de cette chirurgie sur la prise alimentaire, la perte de poids et les améliorations des paramètres glucidiques (Troy et al., 2008) (Figure 12). Mais aucune explication n’avait été apportée quant aux mécanismes d’induction de cette PIG. Or, nous avons récemment démontré que lors des régimes enrichis en protéines, l’inhibition des récepteurs mu-opioïdes par le peptides avait un rôle causal dans l’induction de la néoglucogenèse intestinale (NGI) (Duraffourd et al., 2012). Les peptides issus de la digestion des protéines alimentaires sont effectivement capables d’inhiber les récepteurs mu-opioïdes périportaux, activant ainsi un arc-réflexe central qui va aboutir à l’induction des gènes de la

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NGI (Figure 11). L’augmentation de la PIG résultant de cette induction va alors mener à ses

effets bénéfiques sur la satiété et le métabolisme glucidique (Figure 10).

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés aux rôles causals des protéines de l’alimentation, via les récepteurs mu-opioïdes, et de la NGI dans les effets bénéfiques du BPG. Mon hypothèse de thèse était que l’inhibition des récepteurs mu- opioïdes par les peptides alimentaires pouvait expliquer l’augmentation de la NGI et les effets bénéfiques de cette dernière lors du BPG. Un argument plaidant en faveur de cette hypothèse est que les récepteurs mu-opioïdes sont fortement exprimés dans l’intestin distal or, après BPG, les aliments sont délivrés directement dans l’intestin distal. Nous avons donc supposé qu’après BPG les peptides issus de la digestion des protéines pouvaient inhiber les récepteur mu-opioïdes de l’intestin, en plus des récepteurs mu-opioïdes périportaux, ce qui aurait pour conséquence de potentialiser l’effet d’induction de la NGI.

Afin de tester cette hypothèse, nous avons mis au point le by-pass duodéno-jéjunal chez la souris (Figure 3C). Notre choix s’est porté sur cette chirurgie car elle est tout d’abord moins compliquée à réaliser que le BPG. De plus, le by-pass duodéno-jéjunal reproduit le réarrangement de l’intestin après BPG, et c’est cette composante du BPG qui nous intéresse dans le cas de notre hypothèse de travail.

Nous avons donc tout d’abord étudié le rôle des protéines de l’alimentation dans les effets bénéfiques du by-pass duodéno-jéjunal, grâce à l’utilisation de souris invalidées pour le gène du récepteur mu-opioïde (souris MOR-/-). Le by-pass duodéno-jéjunal a été effectué chez des souris MOR-/- de poids normal ou rendues obèses à l’aide d’un régime hyperlipidique et hyperglucidique. Nous avons étudié les effets de cette chirurgie sur la prise alimentaire, le poids et le métabolisme glucidique et les résultats sont présentés sous la forme d’un article rédigé (article 1).

La deuxième partie de mon travail de thèse m’a conduite à étudier le rôle causal de la NGI dans les effets bénéfiques du by-pass duodéno-jéjunal. Pour cela, nous disposons d’un modèle original de souris récemment développé par notre laboratoire : les souris invalidées pour la sous-unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans l’intestin (souris I-G6pc-/-). Nous avons donc étudié les effets, chez cette souris et chez la souris sauvage, du by-pass duodéno-jéjunal sur la prise alimentaire, le poids et le métabolisme glucidique, mais

51 également sur la modification de la NGI et de la production hépatique de glucose et finalement sur la possible malabsorption. Les résultats de cette étude sont présentés sous la forme d’un article scientifique comprenant les sections introduction, matériels et méthodes et résultats (article 2). Les résultats de cette étude sont discutés dans la discussion générale de cette thèse.

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RESULTATS

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ARTICLE 1

ROLE OF DIETARY PROTEIN SENSING IN THE METABOLIC BENEFITS OF DUODENAL-JEJUNAL BYPASS IN THE MOUSE

Aude Barataud (PhD student)1-3, Daisy Goncalves (PhD)1-3, Jennifer Vinera (PhD student)1-3,

Carine Zitoun (research assistant)1-3, Adeline Duchampt (research assistant)1-3, Amandine

Gautier-Stein (PhD)1-3 and Gilles Mithieux (PhD)1-3.

1 _{Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U855, Lyon, F-69008, France}

2 _{Université de Lyon, Lyon, F-69008, France}

54 ABSTRACT

Background: Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) induces remission or substantial

improvement of type 2 diabetes mellitus (T2DM) but underlying mechanisms are unclear.

This surgery implicates a gut anatomy rearrangement so that nutrients as proteins are

redirected directly in the distal gut. Beneficial effects of dietary proteins on energy and

glucose metabolism are in part mediated by antagonism of mu-opioid receptors (MORs)

surrounding the portal vein. MORs are also highly expressed in the distal gut. We

hypothesized that the beneficial effects of RYGB could depend on the antagonism of

periportal and intestinal MORs by peptides from food.

Methods: Duodenal-jejunal bypass (DJB), which reproduces the gut anatomy modifications

induced after RYGB, was performed in obese and lean wild-type (WT) or MOR deficient

(MOR-/-) mice. Food intake and body weight was monitored daily during 3 weeks. Glucose

homeostasis was assessed by glucose and insulin tolerance tests.

Results: In obese mice, DJB induced a rapid and sustained weight loss partly independent of

food intake, and a rapid improvement of glycaemic parameters. A comparison with sham pair-

fed mice demonstrated that weight loss is the major determinant of the improved metabolic

parameters. In lean mice, DJB had no effect on weight loss but significantly enhanced glucose

tolerance. The effects of DJB were similar in MOR-/- and WT mice whether they were lean or