related to desmosome dysfunction
R ESULTATS COMPLEMENTAIRES 3 : P RODUCTION D ’ UN SERUM ANTI ‐ PEPTIDE
1. La dermokine δ, un nouvel acteur de l’endocytose précoce
a) DMKNδ, une nouvelle GEF ?
Grâce à notre criblage en double hybride chez la levure, nous avons pu identifier les petites GTPases Rab5 comme partenaires de la DMKNδ5. Nous avons montré que celle‐ci est capable d’activer la fonction de Rab5 dans les étapes précoces de l’endocytose. Mais les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore à être élucidés.
La DMKNδ5 active Rab5 en stimulant l’échange du GDP en GTP sur la petite GTPase, mais nous ne savons pas si cette action est directe. En effet, les protéines GDP/GTP Exchange Factor (GEF), réalisant l’échange de nucléotides sur les petites GTPases Rab, ont généralement dans leur séquence un domaine consensus leur conférant ces propriétés (pour revue voir (Barr and Lambright, 2010). Pour les GEFs de la famille Rab5, il s’agit du domaine Vps9, fortement conservé. Nous avons vu dans l’introduction qu’aucun domaine protéique particulier n’est présent dans la séquence de DMKNδ5. Nous pouvons donc supposer que l’activation de Rab5 que l’on observe dans les cellules HeLa n’est pas un effet direct de DMKNδ5. Celle‐ci pourrait recruter une protéine à domaine Vps9 qui échangerait le GDP en GTP sur Rab5 (Figure 61‐1). En effet, c’est l’extrémité NH2‐terminale de la DMKNδ5 qui se lie
à Rab5 et qui colocalise avec la petite GTPase dans des cellules HeLa, mais ce domaine ne semble pas suffisant pour permettre la complète activation de Rab5. L’extrémité COOH‐ terminale de DMKNδ5 pourrait donc recruter un autre partenaire qui aurait une activité GEF. Cependant nous n’avons pas pu confirmer l’interaction avec POR‐1 et n’avons pas trouvé d’autres partenaires que Rab5 dans notre criblage double hybride. Si la DMKNδ5 est capable de lier une protéine à domaine Vps9, l’identité de cette dernière reste donc à être déterminée. Afin d’identifier cet éventuel partenaire, nous pourrions réaliser d’autres criblage en double hybride chez la levure. En effet, au cours de nos expériences nous n’avons criblé que 30% de la banque d’ADNc de kératinocytes humains et avons donc pu manquer de nouvelles cibles. Nous pourrions également réaliser un criblage en double hybride avec une autre banque d’ADNc, provenant de cellules HeLa par exemple, dans laquelle notre éventuel partenaire pourrait être mieux représenté et donc plus facilement identifiable au cours du
La dermokine δ, un nouvel acteur de l’endocytose précoce
Enfin, même si la DMKNδ5 ne semble pas avoir de domaine Vps9 lorsqu’on regarde sa séquence protéique primaire, il est toujours possible qu’elle s’organise de façon similaire en paquet d’hélice pour interagir avec Rab5 et l’activer (Delprato et al., 2004) (Figure 61‐2). Afin de vérifier cette hypothèse et déterminer si la DMKNδ5 possède une activité GEF propre, nous pourrions réaliser un test in vitro d’échange du GDP en GTP (Delprato and Lambright, 2007), avec des protéines recombinantes DMKNδ5 et Rab5. Figure 61 : Mécanismes d’action proposés pour la DMKNδ (1) La DMKNδ pourrait recruter une protéine à domaine Vps9 et lui permettre d’échanger le GDP en GTP de Rab5. (2) La DMKNδ pourrait agir comme une GEF et permettre l’échange du GDP en GTP sur Rab5 de façon directe. b) Les autres isoformes DMKNδ Nous avons réalisé notre étude avec la DMKNδ5, qui se compose de la séquence minimale de 123 acides aminés retrouvée dans toutes les isoformes DMKNδ ainsi que de la séquence codée par l’exon 20. L’interaction de DMKNδ5 avec Rab5 se fait via sa partie NH2‐terminale
et plus précisément par ses 26 premiers acides aminés qui sont communs à toutes les DMKNδ. On peut donc supposer que le rôle de DMKNδ5 dans l’activation de Rab5 peut être extrapolé à toutes les isoformes δ. Cependant, il existe toujours une incertitude quant à la première méthionine. Ceci pourrait donc étendre le domaine NH2‐terminal des DMKN δ1,
δ2‐δ3 et δ4 de 27, 9 et 76 acides aminés respectivement. Il faudrait donc vérifier que ces résidus supplémentaires ne gênent pas la conformation de la protéine et ne perturbent pas son interaction avec Rab5 et/ou avec un autre partenaire.
c) Implications dans l’épiderme
Le kératinocyte granuleux, cellule à laquelle nous nous intéressons plus particulièrement au laboratoire, est caractérisé par la présence de vésicules sécrétoires appelées corps lamellaires. Le protéome de ces structures apparentées aux lysosomes sécrétoires a été réalisé au laboratoire, et les petites GTPases Rab5 ont été identifiées dans les fractions enrichies en corps lamellaires (Raymond et al., 2008). La voie de sécrétion par les lysosomes sécrétoires d’autres tissus, comme pour les corps lamellaires du poumon, est parfois associée à une voie endosomale qui permet le recyclage de certains éléments sécrétés (Fisher et al., 2010). Ainsi, au niveau du kératinocyte granuleux, une voie d’endocytose dirigée par Rab5 et dans laquelle interviendrait la DMKNδ, pourrait être liée à la voie de sécrétion par les corps lamellaires.
2. Les dermokines βγ
Contrairement à la DMKNδ, nos résultats de double hybride chez la levure avec les DMKNβγ ne nous ont pas permis d’élucider la fonction de ces protéines. Nous avons vu dans l’introduction que ces isoformes sécrétées de DMKN sont très fortement exprimées par le kératinocyte granuleux (cf : Paragraphe I.F.1.c). De plus, elles pourraient réguler l’environnement physico‐chimique de l’espace intercornéocytaire, riche en lipides et donc très hydrophobe, en association ou non avec d’autres protéines matricielles (ex : GAL3) (Gazeilles et al., En préparation). Afin de poursuivre leur caractérisation, nous avons entrepris l’étude de souris inactivées pour ces isoformes de Dmkn. Pour cela, la génération de souris hétérozygotes Dmknβγ+/‐ a été réalisée à l’Institut Clinique de la Souris (ICS) à Strasbourg, en collaboration avec notre laboratoire.
a) Obtention des souris Dmknβγ‐/‐
Afin d’inactiver le gène Dmknβγ, nous avons choisi d’utiliser le système Cre‐Lox et la stratégie adoptée a été de supprimer les 5 premiers exons du gène Dmkn murin, spécifiques