La congélation de l'échantillon

2.2.1 Les grilles

J'ai effectué une optimisation approfondie des échantillons par rapport à la distribution de particules et à l'état d'agrégation des objets en cryo-microscopie électronique, notamment en utilisant différents types de grilles commerciales et faites maison, dont des grilles Quantifoil qui sont des grilles en cuivre et en rhodium. Du côté du cuivre de la grille, il y a une feuille de carbone pré- perforée d'environ 10 à 12 nm d'épaisseur qui est formé par évaporation de carbone. Pour ce faire, il y a initialement une couche de plastique qui sert de matrice à la couche de carbone évaporé. A cause de ce procédé, il peut rester des résidus de plastique après fabrication. Ils sont très mauvais pour l'imagerie en microscopie électronique car cela crée une instabilité de l'échantillon. Il est conseillé de laver ses grilles avec de l'acétate d’éthyle avant toute utilisation. Il y a de nombreuses variantes de ces grilles qui existent sur le marché et j'en ai utilisé 3 types, les Quantifoil R1.2/1.3, les Quantifoil R2/2 et les Quantifoil R3.5/1. Le premier chiffre correspond à la taille du trou perforé et le second chiffre correspond à l'espacement entre les trous en µm. Similairement, j'ai également utilisé la version en or (Quantifoil UltrAuFoil) avec une géométrie R1.2/1.3. Pour ces grilles entièrement en or, la feuille perforée fait environ 50 nm d'épaisseur. Le principal avantage de ces grilles est leurs stabilités lors de l'acquisition et sa bonne résistance aux écarts de températures. J'ai utilisé des grilles

C-flat provenant d'un autre fournisseur, ce sont des grilles similaires au Quantifoil avec une feuille de carbone. La principale différence est la méthode de fabrication (nano perforation), qui n'utilise pas de matrice en plastique, elles sont donc directement utilisables sans lavage préalable. Enfin pour les grilles faites maison, je suis parti de grilles commerciales Quantifoil R3.5/1 pour préparer des grilles de carbone continue avec la méthode du carbone flotté. Ces grilles permettent de ne pas avoir de différences sur le support tout au long de la grille, ce qui permet dans certain cas une meilleure distribution des particules. Il y aura néanmoins une légère perte de contraste. Au début du projet j'ai également utilisé et préparé des grilles de coloration négative, l'agent de coloration utilisé étant l'acétate d'uranyle.

Figure 56 : Schéma de la préparation de grilles avec du carbone flotté. Après le dépôt d'une fine couche de carbone par

évaporation sur une plaque de mica, on plonge la plaque dans de l'eau pour faire flotter le carbone à la surface de l'eau. Il suffit ensuite de faire baisser le niveau de l'eau en dessous du niveau où se trouve les grilles puis de laisser sécher.

2.2.2 Système à décharge luminescente

La décharge luminescente (Glow Discharge) est un procédé ayant pour but de rendre le support carbone des grilles plus hydrophiles pour une bonne adsorption de l'échantillon sur la grille. J'ai utilisé deux modèles de machines différentes pour réaliser cette action, un Elmo cordouan et un Fischione model 1070 NanoClean plus récent qui donne une meilleure reproductibilité des résultats. Les grilles sont placées dans une chambre connectée à un générateur électrique qui permet d’ioniser l'air ambiante dans la chambre qui est placée en dépression. Dans le cas de la première machine, la manipulation se fait avec la composition de l'air atmosphérique en dépression (200 mbar), par contre avec la seconde machine on peut choisir sa composition en mélangeant de l'oxygène et de l'argon. L’ionisation du gaz interne va créer du plasma, qui aura pour conséquence l'accumulation de charges

Chapitre 2 - Matériel et méthodes

passer le carbone d'une forme SP3 à SP2. L'effet diminue progressivement pendant les jours qui suivent.

Figure 57 : Photographie d'une décharge luminescente avec une machine Elmo cordouan.

2.2.3 Cryogénisation des échantillons

La cryogénisation des échantillons a été réalisée avec un Vitrobot (MARK IV) qui est le plongeur de FEI. Après l'étape de décharge, on prépare un compartiment en métal remplit d'éthane liquide au centre d'un compartiment plus grand, remplit d'azote liquide pour maintenir le premier au froid. On accroche ensuite une grille sur la pince du plongeur qui l'amène dans une chambre qui est maintenue à température et à hydrométrie constante. Dans mon cas, l'hydrométrie est toujours comprise entre 95 et 100% d'humidité. La plage de température testée va de 4 à 20 degrés Celsius et en fonction du complexe utilisé, la température la plus adaptée n'est pas toujours la même. Pour le dépôt d'échantillons sur la grille, j'ai utilisé une variation allant de 2 à 4 µL. Cependant, il faut noter que 3µL est une quantité adaptée à la grande majorité des cas et est devenue ma valeur par défaut. Ensuite on doit choisir le temps d'incubation de l'échantillon avant absorption par le papier filtre, le temps de l'absorption par papier filtre et la force avec laquelle on plaque le papier contre la grille de part et d'autre. Dans certain cas, j'ai aussi procédé à la mise en place de plusieurs gouttes et plusieurs absorptions sur la même grille afin de reconcentrer l'échantillon sur grille. Après absorption la grille

est immédiatement plongé danse l'éthane liquide pour former de la glace amorphe contenant l'échantillon. Les conditions optimales pour chaque complexe seront décrites dans la partie résultat.