L’interaction Spt6-Iws1 in vitro est uniquement stimulée par la phosphorylation de

La description précise des domaines d’interaction entre Spt6 et Iws1 par cristallographie a permis de mettre en évidence la nature essentielle de la formation du complexe in vivo (McDonald et al., 2010). En effet, la mutation des résidus conduisant à l’abrogation totale de l’interaction Spt6-Iws1 est létale chez S.cerevisiae. Un affaiblissement partiel de l’interaction conduit à une thermosensibilité ainsi qu’à l’apparition d’un phénotype SPT- qui traduit des défauts d’organisation de la chromatine (McDonald et al., 2010). Des résultats préliminaires du laboratoire ont mis en évidence que la phosphorylation de Spt6 par CK2 stimule l’interaction Spt6-Iws1 in vitro et pourrait ainsi jouer un rôle critique dans la régulation fonctionnelle du complexe (Annexe 1-B). L’utilisation d’un mutant phosphomimétique de Spt6, 6xHis-Spt6 7S-D, dans lequel les sérines phosphorylées par CK2 sont mutées en acide aspartique pour mimer une phosphorylation constitutive, a permis de confirmer ces résultats. En effet, un GST-pulldown avec les protéines GST-Iws1 et 6xHis-Spt6 WT ou 7S-D montre que GST-Iws1 interagit plus stablement avec Spt6 7S- D, confirmant que la phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise son interaction avec Iws1 (Annexe 1-C).

Nous nous sommes donc demandé si la phosphorylation d’Iws1 avait elle aussi un rôle modulateur. Afin de tester directement l’impact de la phosphorylation par CK2 sur la stabilité de complexe, nous avons réalisé un GST pull down avec GST-Iws1 WT ou 3A non phosphorylable et 6xHis-Spt6 en présence ou en absence de CK2 fonctionnelle. Les différentes protéines ont été ou non phosphorylées in vitro préalablement au pull down comme indiqué sur la figure 3.3A. Comme mentionné plus haut, la phosphorylation par CK2 stimule l’interaction Spt6-Iws1 in vitro, en revanche on observe que la forme mutante GST-Iws1-3A, où les résidus d’intérêt sont mutés en alanine non phosphorylables, interagit de façon équivalente avec 6xHis-Spt6. De plus, nous avons effectué une expérience de GST pull down avec les formes WT ou phosphomimétique (3D) d’Iws1. La figure 3.3B montre que 6xHis-Spt6 WT co-purifie de façon équivalente avec GST-Iws1 WT ou 3D. De la même façon, 6xHis-Spt6 7S-D interagit également de façon comparable avec GST-Iws1

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WT et 3D. La mutation des résidus d’Iws1 potentiellement phosphorylés par CK2 en acide aspartique n’affecte donc pas l’interaction Spt6-Iws1 in vitro. Ainsi, ces expériences in

vitro montrent que la phosphorylation d’Iws1 par CK2 ne semble pas avoir d’influence sur

la stabilité du complexe Spt6-Iws1, contrairement à la phosphorylation de Spt6 en N- terminal.

Figure 3.3 : La phosphorylation de Iws1 par CK2 ne stimule pas la formation du complexe Spt6-Iws1 in vitro

A- Analyse de l’interaction in vitro des protéines recombinantes 6xHis-Spt6 et GST-Iws1 WT ou

3A non phosphorylable par GST pulldown. GST seul est utilisé comme contrôle négatif. Les protéines recombinantes GST-Iws1 WT ou GST-Iws1-3A sont incubées avec 6xHis-Spt6 en quantité égale et phosphorylées ou non in vitro avant d’être purifiées en présence de CK2 purifiée de levure et d’ATP. B- Analyse de l’interaction in vitro des protéines recombinantes 6xHis-Spt6 WT ou 7S-D et GST-Iws1 WT ou 3D phosphomimétique par GST pulldown. GST seul est utilisé comme contrôle négatif. Les protéines recombinantes GST-Iws1 WT ou GST-Iws1-3D sont incubées avec 6xHis-Spt6 WT ou 7S-D en quantité égale puis purifiées. Les protéines sont séparées sur gel de SDS-PAGE et analysées avec des anticorps dirigés contre les étiquettes His et GST.

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3.5.3. L’interaction Spt6-Iws1 in vivo ne dépend pas de CK2

Nous avons jusqu’ici montré par des analyses in vitro que CK2 semble stabiliser le complexe Spt6-Iws1 via la phosphorylation de Spt6 mais pas celle d’Iws1. Afin d’évaluer l’importance de CK2 in vivo, dans la régulation de la formation du complexe, nous avons réalisé des expériences de co-immunoprécipitation de Spt6 et Iws1 dans des mutants ck2ts. Dans cette optique, nous avons généré de souches WT et ck2ts qui expriment Flag-Spt6 et Iws1-Myc afin de purifier Flag-Spt6 et d’analyser par immunobuvardage le niveau d’Iws1- Myc qui co-précipite à la température restrictive de 37°C. Des souches dans lesquelles Spt6 est non étiquetée sont utilisées comme contrôle. Comme indiqué sur la figure 3.4A, le niveau d’Iws1-Myc est équivalent dans les extraits totaux (input) des souches WT et ck2ts_.

Par contre, la quantité totale de Flag-Spt6 dans la souche ck2ts est drastiquement diminuée par rapport au WT, reflétant l’importance de CK2 dans la stabilité de la protéine (Chapitre 2). Concernant l’interaction Spt6-Iws1, le niveau d’Iws1-Myc immunoprécipité par la purification de Flag-Spt6 est inchangé en présence ou en absence de CK2 fonctionnelle ce qui va à l’encontre des données obtenues in vitro. Afin de nous assurer que l’interaction Spt6-Iws1 n’est pas affectée par l’absence de CK2 in vivo, nous avons donc également utilisé une approche alternative plus stringente de purification en tandem (TAP). Les cellules WT et ck2ts _{utilisées dans cette expérience expriment Spt6-TAP. Les produits de}

purification de Spt6 à une température permissive (30°C) ou restrictive (37°C) ont été séparés sur gel SDS-PAGE et analysés par coloration à l’argent. Comme précédemment, on observe que l’inactivation de CK2 n’affecte pas l’interaction Spt6-Iws1 dans des extraits protéiques totaux (Fig. 3.4B). Ainsi, nos analyses in vivo contredisent l’hypothèse selon laquelle CK2 régule la formation du complexe Spt6-Iws1.

En résumé, la phosphorylation de Spt6 par CK2 stimule l’interaction avec Iws1 in vitro, ce que nous n’avons pas été en mesure de mettre en évidence in vivo. De plus, la quantité totale de Spt6 est affectée sans pour autant avoir un effet sur le complexe dans des extraits totaux in vivo. Nous suspectons donc que la stabilité de Spt6 est affectée quand Spt6 n’est pas complexé à Iws1.

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Figure 3.4 : CK2 ne semble pas affecter l’interaction Spt6-Iws1 in vivo

A- Co-Immunoprécipitation de Flag-Spt6 et Iws1-Myc. Des souches WT et ck2ts exprimant Iws1- Myc sont transformées avec Pcc11 Flag-Spt6 ou un vecteur vide qui sert de contrôle. Les protéines totales sont extraites après 2h à 37°C et purifiées sur des billes d’agarose anti-Flag. Les protéines purifiées sont séparées sur gel et analysées par immunobuvardage avec des anticorps dirigés contre les épitopes Flag et Myc. B- Purification de Spt6-TAP sur des extraits protéiques totaux issus de souches WT et ck2ts _{exprimant Spt6-TAP à 30°C et après 2h à 37°C. Les protéines purifiées sont}

séparées sur des gels SDS-PAGE de gradient 4-12% et analysées par coloration à l’argent.

3.5.4. Fonctionnellement, seule la phosphorylation de Spt6 semble importante dans le