L’identification et la validation des gènes candidats

Dans les cas optimaux, les analyses de liaison génétique associeront le contrôle du phénotype étudié à une région réduite du génome, incluant un ou quelques gènes spécifiques. De là, on peut inférer l’effet des différents polymorphismes grâce à des outils informatiques, et réduire la liste aux gènes portant les polymorphismes les plus potentiellement intéressants. L’utilisation d’approches expérimentales permettant de déterminer les types cellulaires et voies biologiques impliquées dans un phénotype sont aussi une étape cruciale dans l’investigation de gènes candidats. Par exemple, des chimères hématopoïétiques et des analyses d’expression génique, par exemple le séquençage d’acide ribonucléique (RNA-seq) ou l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) peuvent apporter d’importants indices

quant aux mécanismes impliqués dans une différence de phénotype entre deux lignées de souris, ou encore dans le contrôle général d’une population cellulaire. De plus en plus d’outils informatiques permettent d’optimiser l’étape de recherche de gènes candidats en intégrant des données d’expression, d’interaction, etc. Toutefois, une validation biologique demeure nécessaire pour confirmer l’effet d’un ou plusieurs gènes ou polymorphismes. De nombreuses façons de procéder existent, de la validation d’un locus à la validation d’un gène ou même d’une mutation spécifique. Des méthodes de validation seraient également utilisées chez l’humain, mais il sera ici uniquement question de validation chez la souris, qui représente un modèle génétique plus malléable.

1.3.3.1 Les souris congéniques

Une première approche pouvant être utilisée suite à l’identification d’un locus régulant potentiellement un phénotype est de vérifier l’impact de ce locus dans son ensemble, sans limiter à un seul gène. Par exemple, chez la souris, il est possible de recourir à des lignées dites « congéniques », c‘est-à-dire génétiquement identiques à une lignée parentale, à l’exception d’un locus d’intérêt dont le génotype provient d’une autre lignée de souris. De telles souris congéniques sont générées par rétrocroisement, sur plusieurs générations, d’une souris F1 avec la lignée parentale dont sera conservé le fond génétique. À chaque génération, seules les souris hétérozygotes au locus d’intérêt seront rétrocroisées à nouveau. Après plusieurs croisements de la sorte, les souris seront génétiquement identiques à la lignée parentale, à l’exception du locus d’intérêt qui sera hétérozygote. L’intercroisement des animaux hétérozygotes donnera finalement naissances à des individus homozygotes pour le locus congénique. L’étude de différences entre les souris des lignées parentales et de la lignée congénique permet d’évaluer la contribution du locus d’intérêt à différents phénotypes. Par exemple, la génération de souris B6 congéniques pour l’haplotype H-2g7 du CMH (B6.H-2g7) et de souris NOD congéniques pour l’haplotype H-2b du CMH (NOD.H-2b) a permis de révéler que le CMH est nécessaire mais non suffisant au développement du diabète chez les souris [365]. D’ailleurs, plusieurs lignées de souris congéniques pour des locus Idd associés à la résistance au diabète ont été utilisées pour confirmer ou infirmer le rôle de ces locus dans

divers aspects du développement de la maladie [248]. Les régions congéniques contiennent souvent un nombre élevé de gènes. Afin de diminuer la liste de gènes candidats influençant les phénotypes étudiés, il est possible de réduire davantage les locus congéniques en générant des lignées sous-congéniques. Ces lignées sont essentiellement obtenues lors de l’établissement initial d’une lignée congénique en sélectionnant des individus présentant des recombinaisons différentes, ou grâce à des rétrocroisements supplémentaires d’une lignée déjà établie [366- 368].

1.3.3.2 Les modèles ko et ko conditionnels

Un fois un gène candidat identifié, l’utilisation de souris déficientes (ko) pour ce gène peut permettre de mieux étudier son rôle dans la détermination des phénotypes d’intérêt. Toutefois, il importe de garder à l’esprit qu’une délétion complète d’un gène agira potentiellement différemment d’un polymorphisme naturellement présent. Des souris ko existent pour plusieurs gènes, et ont été générées grâce au remplacement desdits gènes par, typiquement, une cassette de résistance aux antibiotiques. Le remplacement du segment génique grâce au processus de recombinaison homologue produit des cellules possédant une copie non-fonctionnelle du gène. La sélection de cellules ayant intégré la mutation, leur insertion dans un embryon, et le croisement subséquent de souris portant la délétion du gène permet ultimement l’établissement de lignées de souris ko [369]. Comme la délétion de certains gènes est létale, des modèles de délétion conditionnelle existent également. Par exemple, le système cre-lox utilise l’expression transgénique de la recombinase cre sous le contrôle d’un promoteur donné et l’introduction de séquences loxP (reconnues par la recombinase cre) flanquant la séquence à supprimer [370]. Dans ce type de modèle, seules les cellules exprimant cre perdront l’expression du gène cible. Un tel modèle s’avère précieux lorsqu’une délétion du gène d’intérêt est létale durant le développement embryonnaire, ou pour étudier l’effet d’une délétion sélective à un type cellulaire ou à un stade particulier du développement.

Outre l’utilisation de souris ko, il est aussi possible d’utiliser des petits ARN interférants (siRNA) afin de cibler les gènes d’intérêt et en diminuer l’expression. La technologie CRISPR/Cas9 peut quant à elle s’avérer un outil précieux pour introduire des mutations spécifiques et tester l’effet de polymorphismes précis et pour augmenter ou diminuer l’expression d’un gène [371]. Ces deux technologies peuvent permettre de tester rapidement plusieurs gènes candidats in vivo, et l’introduction de mutations ciblées via CRISP/Cas9 peut par exemple représenter plus physiologiquement qu’un modèle ko l’effet de polymorphismes présents dans des souris congéniques.