et´e ensuite broy´ees, l’ARN extrait puis reverse-transcript, et l’expression de spen analys´ee par q-PCR (Fig. 3.12a).
3.2.2 L’exposition au paraquat entraˆıne une perte des neurones dopaminergiques et l’apparition de d´efauts
locomoteurs et de survie
Les d´efauts de locomotion visibles chez les malades atteints de Parkinson sont une cons´equence de la perte des neurones dopaminergiques particuli` e-rement sensibles au stress oxydatif (Fahn and Cohen 1992). Afin de v´erifier la toxicit´e de l’exposition des mouches au paraquat sur les neurones dopa-minergiques, nous avons mesur´e la viabilit´e des neurones dopaminergiques en regardant l’activit´e transcriptionnelle de quatre g`enes impliqu´es dans le m´etabolisme de la dopamine : vmat, ddc, pale et dat. Pale et ddc sont impli-qu´es dans le m´etabolisme de la dopamine, vmat et dat sont impliqu´es dans le transport de la dopamine (Greer et al. 2005, Bertoldi 2014, Budnik and White 1987). Ces enzymes sont sp´ecifiques des neurones dopaminergiques. Ainsi la mort de ces neurones se traduit directement par la perte d’expres-sion de ces g`enes. Nous avons analys´e l’expression de ces g`enes sur des extraits ARNm de tˆetes apr`es avoir expos´e les mouches au paraquat. Nous avons mon-tr´e que d`es 12 heures apr`es le d´ebut d’un traitement au paraquat, l’activit´e des quatre g`enes li´es au m´etabolisme de la dopamine est s´ev`erement r´eduite (Fig. 3.12b). Ce r´esultat montre que l’exposition des mouches au paraquat af-fecte s´ev`erement la survie des neurones dopaminergiques. Chez l’homme, les corps cellulaires des neurones dopaminergiques situ´es au niveau de la sub-stance noire projettent vers le striatum et sont essentiels `a l’initiation des mouvements volontaires (Grace et al. 2007). Afin de comprendre si l’expres-sion de spen est requise pour la r´esistance `a un stress oxydatif, nous avons dans un premier temps valid´e plusieurs tests permettant d’´evaluer la r´eponse des mouches `a un traitement au paraquat.
Fig. 3.12. L’expression de spen est modul´ee en r´eponse au paraquat (PQ), un agent chimique induisant la mort des neurones dopaminergiques. (a) L’expression de l’ARNm de spen diminue en r´eponse `a un traitement PQ (10 mM) de 24 h. Les ARNs ont ´et´e isol´es `a partir de 25 mouches mˆales ˆag´ees de 72h puis r´etro-transcripts avant d’ˆetre analys´es par qPCR. Les donn´ees repr´esentent la moyenne de quatre exp´eriences ind´ependantes avec l’´ecart-type. Test non-param´etrique de Mann-Whitney. ∗p < 0, 05. (b) Dosage des transcrits de g`enes codant pour des prot´eines impliqu´ees dans le m´etabolisme de la dopamine. Les ARNm ont ´et´e isol´es `a partir de 25 mouches mˆales apr`es traitement au PQ (10 mM) ou en condition contrˆole. Le traitement au paraquat entraˆıne une diminution de l’expression des 4 g`enes refl´etant la mort des neurones dopaminergiques. Les r´esultats sont issus de deux r´eplicas biologiques ind´ependants. (c) Capacit´es de mouches sauvages ˆ
ag´ees de 72h `a monter sur la paroi d’un tube apr`es traitement au PQ. Chaque condition correspond `a un groupe de 20 mˆales apr`es un traitement de 24, 48 ou 72h de PQ (10 mM) (histogrammes gris) ou en condition contrˆole (histogrammes blancs). Test de Student : ∗ ∗ p < 0, 001 ∗ ∗ ∗p < 0, 0001. (d) Evaluation de la survie de mouches sauvages expos´ees au PQ. Des groupes de 20 males sont plac´es sur diff´erents milieux contenant diff´erentes concentrations de paraquat. Leur survie sur ces milieux est ´evalu´ee au cours du temps.
Les deux tests utilis´es sont : un premier test fonctionnel ´evaluant les d´efauts locomoteurs des mouches, et un deuxi`eme ´evaluant la survie apr`es traitement.
1) Le test locomoteur consiste `a analyser la capacit´e des mouches `a mon-ter le long d’un tube par g´eotaxie n´egative. Pour cela, des mouches ˆag´ees de 3 jours sont trait´ees ou non au paraquat et plac´ees ensuite dans des tubes vides. Leur capacit´e `a grimper le long de ce tube est ´evalu´ee par rapport `
a des mouches contrˆoles n’ayant pas ´et´e mises en pr´esence de paraquat. Les mouches contrˆoles (milieu non-suppl´ement´e) mettent en moyenne six secondes `a monter en haut du tube, que ce soit 12, 24 ou 48 heures apr`es le traitement. En revanche, les mouches mises sur paraquat mettent environ huit secondes `a monter 12 heures apr`es le traitement et jusqu’`a 30 secondes deux jours apr`es la mise sur paraquat (Fig. 3.12c).
2) Le second test consiste `a ´evaluer la survie des mouches en r´eponse au traitement paraquat. Pour cela des mouches ˆag´ees de 3 jours sont nourries sur du milieu contenant du paraquat ou non (contrˆole). Le nombre de mouches mortes au cours du temps est ´evalu´e dans les jours suivants le traitement. Ainsi, moins de 10 jours apr`es l’exposition `a 10 mM de paraquat, l’int´egralit´e des mouches aura succomb´e (Fig. 3.12d). La r´eponse est par ailleurs dose d´ependante, car si l’on soumet les mouches `a un paraquat deux fois plus concentr´e c’est `a dire de 20 mM, les mouches meurent plus rapidement. Une ´
equipe a ´egalement montr´e qu’une application directe du PQ au niveau du cerveau des drosophiles induisait une r´eponse beaucoup plus rapide et ce mˆeme pour des doses inf´erieures (Rival et al. 2004).
Nous disposons ainsi de deux tests fonctionnels permettant d’´evaluer la r´eponse des mouches `a un stress oxydatif suivant l’ingestion de paraquat.
3.2.3 Spen est exprim´e ubiquitairement dans le cerveau adulte