L’effet de la présence d’une image dans les messages

Tal como para o ensaio de PCR, o ensaio imunológico de ELISA para quantificação de microcistinas foi realizado para as amostras ambientais, assim como para as amostras ambientais com vista a optimização do volume de amostragem e para as estirpes cultivadas. Todos os valores de toxina determinados abaixo de 0,1μg/L de Microcistina- LR (MC-LR) equivalentes foram considerados negativos, pois estão fora da recta padrão traçada.

Para as amostras ambientais, os resultados de ELISA estão apresentados na figura 26. Os resultados estão expressos em μg de MC-LR equivalentes/L. Este ensaio teve como objectivo não só quantificar a toxina nas amostras naturais, mas também permitir distinguir entre a quantidade de toxina liberta no meio (amostra ambiental: AA) e a quantidade total de toxina, ou seja, endógena e exógena (amostra total: AT). Para determinar a quantidade total da toxina, as células foram previamente submetidas a ultra- sons e congeladas, para provocar a ruptura e assim libertar a toxina endógena. Com excepção da amostra do Torrão a 1-Out, em todas as outras não se detectou a toxina na amostra ambiental. Nas duas últimas datas, para os dois locais, não foi detectada a toxina.

O maior valor de toxina determinado foi de 10,62 μg/L de MC-LR equivalentes na data de 1-Out para a amostra total do Marco.

O ensaio de ELISA para optimização do volume de amostragem foi realizado nas datas de 15-Out e de 29-Out para os dois locais, tendo-se amostrado volumes entre 50 e 1000mL para a primeira data e 15 e 50 mL para a segunda. Os valores de toxina resultantes deste ensaio foram todos inferiores a 0,1μg/L de MC-LR equivalentes, considerando-se negativos.

Resultados

Figura 26 - Comparação dos resultados da análise de ELISA para as amostras ambientais. Os valores estão expressos em μg MC-LR equivalentes por litro. ELISA AA corresponde ao ensaio de ELISA para a quantidade de toxina existente no meio e ELISA AT a quantidade total da toxina (toxina no meio+toxina endógena).

Os resultados do ensaio imunológico de ELISA para as estirpes estão sumariados na tabela IX. O ensaio foi realizado para todas as estirpes que apresentaram pelo menos a amplificação de um dos genes envolvidos na produção da toxina, com excepção da estirpe 5 devido à inexistência de biomassa suficiente para realização do ensaio. Para além destas, o ensaio foi também realizado para as estirpes de M. aeruginosa 6 e 7, as quais não apresentaram amplificação para nenhum dos genes envolvidos na biossíntese da toxina. As estirpes de M. aeruginosa que apresentaram amplificação para os genes mcyA, mcyB, mcyE e para o fragmento HEP, estirpes 9 e 16, obtiveram valores de toxina acima dos 1,1 μg/L de MC-LR equivalentes. Nas estirpes sem amplificação por PCR de nenhum destes 4 genes, como é o caso das estirpes 6 e 7, não foi detectada a toxina. Resultados semelhantes foram obtidos para as estirpes 15 e 19, que apresentaram apenas amplificação para um dos genes envolvidos na produção da toxina, respectivamente, para o fragmento HEP e mcyE. A estirpe 1, A. flos-aquae, apresentou valores de toxina de MC-LR equivalente de 0,28μg/L.

Tabela IX - Resultados da quantificação da toxina por análise de ELISA das estirpes cultivadas em μg de MC-LR equivalentes/L Estirpe μg MC-LR equivalentes/L 1 0,28 6 0 7 0 9 1,14 15 0 16 1,16 19 0 19- Set ELISA AT 0,35 ELISA AA 0 0 2 4 6 8 10 12 μ g/ L M C -LR eq u iv a len tes Resultados

Figura 26 - Comparação dos resultados da análise de ELISA para as amostras ambientais. Os valores estão expressos em μg MC-LR equivalentes por litro. ELISA AA corresponde ao ensaio de ELISA para a quantidade de toxina existente no meio e ELISA AT a quantidade total da toxina (toxina no meio+toxina endógena).

Os resultados do ensaio imunológico de ELISA para as estirpes estão sumariados na tabela IX. O ensaio foi realizado para todas as estirpes que apresentaram pelo menos a amplificação de um dos genes envolvidos na produção da toxina, com excepção da estirpe 5 devido à inexistência de biomassa suficiente para realização do ensaio. Para além destas, o ensaio foi também realizado para as estirpes de M. aeruginosa 6 e 7, as quais não apresentaram amplificação para nenhum dos genes envolvidos na biossíntese da toxina. As estirpes de M. aeruginosa que apresentaram amplificação para os genes mcyA, mcyB, mcyE e para o fragmento HEP, estirpes 9 e 16, obtiveram valores de toxina acima dos 1,1 μg/L de MC-LR equivalentes. Nas estirpes sem amplificação por PCR de nenhum destes 4 genes, como é o caso das estirpes 6 e 7, não foi detectada a toxina. Resultados semelhantes foram obtidos para as estirpes 15 e 19, que apresentaram apenas amplificação para um dos genes envolvidos na produção da toxina, respectivamente, para o fragmento HEP e mcyE. A estirpe 1, A. flos-aquae, apresentou valores de toxina de MC-LR equivalente de 0,28μg/L.

Tabela IX - Resultados da quantificação da toxina por análise de ELISA das estirpes cultivadas em μg de MC-LR equivalentes/L Estirpe μg MC-LR equivalentes/L 1 0,28 6 0 7 0 9 1,14 15 0 16 1,16 19 0 19- Set 01- Out 15- Out 29- Out 19- Set 01- Out 15- Out 29- Out Marco Torrão 0,35 10,62 0 0 0,19 1,53 0 0 0 0 0 0 0 0,3 0 0 Resultados

Figura 26 - Comparação dos resultados da análise de ELISA para as amostras ambientais. Os valores estão expressos em μg MC-LR equivalentes por litro. ELISA AA corresponde ao ensaio de ELISA para a quantidade de toxina existente no meio e ELISA AT a quantidade total da toxina (toxina no meio+toxina endógena).

Os resultados do ensaio imunológico de ELISA para as estirpes estão sumariados na tabela IX. O ensaio foi realizado para todas as estirpes que apresentaram pelo menos a amplificação de um dos genes envolvidos na produção da toxina, com excepção da estirpe 5 devido à inexistência de biomassa suficiente para realização do ensaio. Para além destas, o ensaio foi também realizado para as estirpes de M. aeruginosa 6 e 7, as quais não apresentaram amplificação para nenhum dos genes envolvidos na biossíntese da toxina. As estirpes de M. aeruginosa que apresentaram amplificação para os genes mcyA, mcyB, mcyE e para o fragmento HEP, estirpes 9 e 16, obtiveram valores de toxina acima dos 1,1 μg/L de MC-LR equivalentes. Nas estirpes sem amplificação por PCR de nenhum destes 4 genes, como é o caso das estirpes 6 e 7, não foi detectada a toxina. Resultados semelhantes foram obtidos para as estirpes 15 e 19, que apresentaram apenas amplificação para um dos genes envolvidos na produção da toxina, respectivamente, para o fragmento HEP e mcyE. A estirpe 1, A. flos-aquae, apresentou valores de toxina de MC-LR equivalente de 0,28μg/L.

Tabela IX - Resultados da quantificação da toxina por análise de ELISA das estirpes cultivadas em μg de MC-LR equivalentes/L Estirpe μg MC-LR equivalentes/L 1 0,28 6 0 7 0 9 1,14 15 0 16 1,16 19 0

Resultados

O ensaio enzimático de ELISA, para as amostras ambientais e para a estirpe 1 foram também realizados para detecção de cilindrospermopsina. Todos os resultados deste ensaio foram negativos, havendo assim coerência entre os resultados de PCR, em que não se amplificou qualquer fragmento de genes envolvidos na biossíntese desta toxina, e os do ensaio de ELISA.

Por HPLC não foi possível detectar a presença de MC-LR. Com base nos cromatogramas da análise de HPLC para o padrão, foi possível determinar que o tempo de retenção para MC-LR foi de aproximadamente 12±0,1 minutos. Na figura 27 é possível ver um dos cromatogramas obtidos pela análise de HPLC. No mesmo tempo de retenção do padrão (aproximadamente aos 12 minutos) surgiram em todas as datas do Marco picos mas com um espectro de absorção que não a 238nm. Este pico pode ser relativo a um outro péptido que possa estar presente na amostra, com a mesma afinidade (polaridade) que a MC-LR para a coluna. No espectro de HPLC, em algumas datas surgem dois grandes picos (com tempo de retenção de aproximadamente de 20 min) mas com um espectro de absorção a 268 nm, pelo que não podem ser relativas a outras variantes de microcistinas. Algumas microcistinas são caracterizadas por possuírem um espectro a 220 nm, como as que possuem triptofano. Uma vez que os picos obtidos, em qualquer dos tempos de retenção não são nem a 238nm, nem a 220nm, por HPLC não foram detectadas microcistinas.

Figura 27 - Cromatograma resultante da análise de HPLC para a amostra ambiental do Marco a 19 de Setembro.

Pico com tempo de retenção aos 12 min

Resultados

O ensaio enzimático de ELISA, para as amostras ambientais e para a estirpe 1 foram também realizados para detecção de cilindrospermopsina. Todos os resultados deste ensaio foram negativos, havendo assim coerência entre os resultados de PCR, em que não se amplificou qualquer fragmento de genes envolvidos na biossíntese desta toxina, e os do ensaio de ELISA.

Por HPLC não foi possível detectar a presença de MC-LR. Com base nos cromatogramas da análise de HPLC para o padrão, foi possível determinar que o tempo de retenção para MC-LR foi de aproximadamente 12±0,1 minutos. Na figura 27 é possível ver um dos cromatogramas obtidos pela análise de HPLC. No mesmo tempo de retenção do padrão (aproximadamente aos 12 minutos) surgiram em todas as datas do Marco picos mas com um espectro de absorção que não a 238nm. Este pico pode ser relativo a um outro péptido que possa estar presente na amostra, com a mesma afinidade (polaridade) que a MC-LR para a coluna. No espectro de HPLC, em algumas datas surgem dois grandes picos (com tempo de retenção de aproximadamente de 20 min) mas com um espectro de absorção a 268 nm, pelo que não podem ser relativas a outras variantes de microcistinas. Algumas microcistinas são caracterizadas por possuírem um espectro a 220 nm, como as que possuem triptofano. Uma vez que os picos obtidos, em qualquer dos tempos de retenção não são nem a 238nm, nem a 220nm, por HPLC não foram detectadas microcistinas.

Figura 27 - Cromatograma resultante da análise de HPLC para a amostra ambiental do Marco a 19 de Setembro.

Pico com tempo de retenção aos 12 min

Resultados

O ensaio enzimático de ELISA, para as amostras ambientais e para a estirpe 1 foram também realizados para detecção de cilindrospermopsina. Todos os resultados deste ensaio foram negativos, havendo assim coerência entre os resultados de PCR, em que não se amplificou qualquer fragmento de genes envolvidos na biossíntese desta toxina, e os do ensaio de ELISA.

Por HPLC não foi possível detectar a presença de MC-LR. Com base nos cromatogramas da análise de HPLC para o padrão, foi possível determinar que o tempo de retenção para MC-LR foi de aproximadamente 12±0,1 minutos. Na figura 27 é possível ver um dos cromatogramas obtidos pela análise de HPLC. No mesmo tempo de retenção do padrão (aproximadamente aos 12 minutos) surgiram em todas as datas do Marco picos mas com um espectro de absorção que não a 238nm. Este pico pode ser relativo a um outro péptido que possa estar presente na amostra, com a mesma afinidade (polaridade) que a MC-LR para a coluna. No espectro de HPLC, em algumas datas surgem dois grandes picos (com tempo de retenção de aproximadamente de 20 min) mas com um espectro de absorção a 268 nm, pelo que não podem ser relativas a outras variantes de microcistinas. Algumas microcistinas são caracterizadas por possuírem um espectro a 220 nm, como as que possuem triptofano. Uma vez que os picos obtidos, em qualquer dos tempos de retenção não são nem a 238nm, nem a 220nm, por HPLC não foram detectadas microcistinas.

Figura 27 - Cromatograma resultante da análise de HPLC para a amostra ambiental do Marco a 19 de Setembro.

Pico com tempo de retenção aos 12 min

Resultados