A cromatografia em suas principais modalidades e emprego dos mais diversos detectores têm sido ferramenta a fundamental e largamente utilizada na separação e identificação de COV. Sistemas modernos de bibliotecas eletrônicas de massas auxiliam na identificação das substâncias, através da comparação das características dos espectros de massas obtidos, com espectros padrões, armazenados na memória do computador.
Há, ainda, as técnicas olfatométricas, as quais correlacionam os compostos identificados por espectrometria de massas com a importância odorífera de cada volátil no aroma e sabor dos alimentos.
2.8.2.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma amostra através da distribuição destes entre duas fases, uma que permanece estacionária e a outra que se move através dela em uma direção definida (fase móvel). A separação cromatográfica se dá através dos diferentes graus de interação de cada componente da amostra com a fase estacionária e com a fase móvel, a qual pode ser líquida ou gasosa. Desta forma, cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais dos mesmos43.
2.8.2.1.1 CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Na CLAE (figura 8), a fase móvel é bombeada sob alta pressão e a uma vazão controlada. Uma pequena quantidade de amostra é introduzida por meio de uma válvula de injeção, sendo conduzida pela fase móvel através da coluna, onde ocorre a separação dos componentes, e ao detector. A fase móvel, contendo os componentes da amostra já separados, ao sair da coluna chega ao detector onde um sinal, proporcional à concentração de cada soluto, é enviado ao registrador ou integrador43.
Figura 8. Componentes básicos de um cromatógrafo a líquido48.
Os quatro tipos de cromatografia na qual a fase móvel é um líquido são: cromatografia líquido-sólido ou por adsorção, cromatografia líquido-líquido ou por partição com ou sem fase quimicamente ligada, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Dentre estas, a cromatografia líquida com fase quimicamente ligada tornou-se a mais amplamente utilizada39, devido à maior estabilidade térmica e mecânica da fase estacionária43.
Há dois tipos de cromatografia líquida de fase quimicamente ligada, a depender da polaridade das fases móvel e estacionária: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa.
A cromatografia que emprega fase normal baseia-se em uma fase estacionária altamente polar, suportada em partículas de sílica ou alumina, e uma fase móvel apolar. Já na cromatografia em fase reversa, a fase estacionária é mais apolar e a fase móvel mais polar. A fase estacionária na fase reversa normalmente é um hidrocarboneto de cadeia longa, como uma cadeia C8 (n-octil) ou uma cadeia C18 (n-octadecil)39.
As colunas mais comumente utilizadas em CLAE são as de fase reversa, por apresentarem uma série de vantagens, tais como: estabilidade da fase frente a solventes; o equilíbrio da coluna é conseguido rapidamente após a mudança da fase móvel; podem ser facilmente empregadas técnicas de programação, incluindo eluição por gradiente; análises rápidas, reprodutibilidade dos tempos de retenção e campo de aplicação amplo43.
Os detectores mais utilizados na CLAE são os de absorção de radiação no UV-Vis, de fluorescência, de índice de refração, de condutividade elétrica e
os espectrômetros de massas. O sucesso da análise dependerá da escolha apropriada da coluna e do módulo de detecção.
2.8.2.1.2 CROMATOGRAFIA A GÁS (CG)
Há dois tipos de cromatografia na qual a fase móvel é um gás: cromatografia gás-sólido ou de adsorção e cromatografia gás-líquido ou de partição. Devido à grande diversidade de fases líquidas disponíveis, a cromatografia gás-líquido é a mais versátil e seletiva forma de cromatografia em fase gasosa. Isso permite que sejam analisadas amostras sólidas, líquidas ou gasosas, desde que sejam voláteis ou possam ser volatilizadas, sem sofrerem decomposição no cromatógrafo50.
No cromatógrafo a gás (figura 9), a amostra é introduzida em um ponto do sistema denominado injetor, e daí segue junto com o gás de arraste para a coluna cromatográfica. Na coluna, os componentes da amostra seguem a diferentes velocidades, a depender de sua interação com a fase estacionária. Estes componentes, depois de separados, passam por um detector que envia um sinal ao registrador ou integrador, o qual é proporcional às suas quantidades ou concentrações.
Figura 9. Diagrama de blocos com os principais módulos de um cromatógrafo a gás:
1. sistema de gás carreador; 2. sistema de injeção; 3. coluna cromatográfica; 4. sistema de detecção; 5. registrador.
As colunas utilizadas em cromatografia a gás podem ser empacotadas ou capilares, sendo estas últimas as mais utilizadas atualmente devido à eficiência de separação bastante superior às empacotadas49,50.
O material mais comum para a confecção do tubo de invólucro das colunas capilares é a sílica fundida, que é um material inerte. A parede externa do tubo é recoberta com poliamida para que adquira resistência mecânica. As paredes internas são inerentemente lisas e o tubo tem uma grande flexibilidade, facilitando a conexão ao injetor e detector do cromatógrafo49.
Devido ao volume interno pequeno das colunas capilares, onde a fase estacionária é aplicada sob a forma de filmes finos, é necessário que a quantidade de amostra que é introduzida na coluna seja pequena. Para que isto seja conseguido utiliza-se em geral um divisor de amostras, que se situa entre o injetor e a coluna49. O divisor recebe a amostra, vaporizada pelo injetor, e a divide em duas frações desiguais, sendo que a menor delas é a que vai para a coluna. Este modo de injeção é denominado split. Há também o modo splitless, no qual não há divisão da amostra, e que é adequado para a análise de traços, quando é necessário ter maiores quantidades de amostra chegando ao detector para se obter uma resposta mensurável49.
Alguns dos detectores utilizados com maior freqüência na cromatografia a gás são o de condutividade térmica (DCT), o de ionização em chama (DIC), o de captura de elétrons (DCE), detector fotométrico de chama (DFC) e espectrômetro de massas (EM).