L’ablation conditionnelle de sox10 chez des souris adultes entraine des alterations

Aussi bien l’analyse macroscopique que celle des composés du potentiel d’action réalisée sur des altérations structurales sur les nerfs sciatiques traités au tamoxifène sur des souris Sox10fl/fl

PLP ::CreERT2, Bremer et al., 2001 ont réalisé des analyses histologiques et morphologiques detaillées. A 7 ou 15 dpi, il n’y a pas de differences fondamentales sur les sections « semithin » entre les nerfs sciatiques des souris contrôles et ceux des souris Sox10fl/fl PLP ::CreERT2 traitées au tamoxifène. Ceci est corrélé avec l’absence d’altérations phénotypiques chez ses souris à ce moment. Par contre, le nombre de gaine de myéline est nettement reduit dans les nerfs sciatiques des souris Sox10fl/fl PLP ::CreERT2 traités au tamoxifène. Par comparaison aux nerfs contrôles, les nerfs provenant des animaux traités au tamoxifène avaient un aspect inégal avec quelques zones pratiquement dépourvues d’axones myélinisés tandis que d’autres présentaient une densité proche de la normale. On obtient les mêmes résultats lorsque les gaines de myéline sont mises en évidence à travers une immunohistochimie de la protéine MBP. De même, on remarque une reduction du nombre d’axones à travers une immunohistochimie de Tuj1. Parmi les axones qui seraient myélinisés en fonction de la taille de leur calibre, des axones de diamètre large apparaissaient surrepresentés dans les nerfs sciatiques des souris Sox10fl/fl

PLP : CreERT2 traitées au tamoxifène, ce qui est dû au fait qu’une fraction significative d’axones avait un diamètre au dessus de β,5µm. Les gaines de myéline étaient absentes dans environ 20% des axones, qui devraient être myélinisés selon leur calibre au g ratio (rapport numérique entre le diamètre de l’axone et celui de la fibre myélinisée). L’épaisseur de la gaine de myéline des axones restants ne differait pas significativement de la situation dans les nerfs sciatiques des animaux non traités, et la repartition des g ratios était similaire entre les animaux traités au tamoxifène et les animaux non traités. Même lorsque les axones sont mis au contact des cellules en fonction de leur diamètre, les g ratios des differents groupes étaient comparables. Il en découle de ces analyses histologique et morphométrique qu’il ya moins d’axones

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myélinisés chez les souris Sox10fl/fl PLP:: CreERTβ traitées au tamoxifène et qu’il ya une grande fraction d’axones de gros calibre sans myéline. Un nombre substantiel d’axones reste encore normalement myélinisé. Par contre, des axones avec de la myéline mince n’étaient pas observés pour un nombre significatif. Cela est en faveur de l’absence de remyelinisation significative à ce stade. La présence continue de quelques axones normalement myélinisés était évidente à un niveau ultrastructural à la suite des études au microscope électronique. Etait également présent un changement ultrastructural global. Les nerfs sciatiques de souris non traitées présentaient des axones de gros calibre densement myélinisés avec des faisceaux de Remak intercalés, chacun consistant en une non-myélinisation par les cellules de Schwann associées à des axones de petits calibres tandis que les nerfs sciatiques siatiques des souris traitées au tamoxifène présentaient une dimunition globale du nombre d’axones avec de la myéline souvent moins dense. Une fraction substantielle de ces myélines apparait désorganisée et parfois une absence d’axone intact. Il y avait une présence significative de myéline fragmentée et de débris myéliniques. Un nombre considérable d’axones est entouré de cellules de Schwann contenant des quantités trop élevées de cytoplasme remplie de structures vésiculaires. Il y avait également la présence d’axones de gros calibre sans gaine de myéline pourtant entourés de cellules de Schwann. Rarement, il y avait des axones sans cellules de Schwann autour. L’analyse ultrastructurale confirme la présence de cellules de Schwann avec des propriétés modifiées, une démyélinisation, une dégénerescence axonale et une inflammation dans les nerfs sciatiques des souris Sox10fl/fl PLP:: CreERT2.

III. Krox20 (Egr2) est indispensable pour la maintenance de la myéline périphérique

A. Sa mutation conditionnelle entraine une absence de myelinisation

Le modèle de souris pour la myelinisation défectueuse developpés sur la base de deux mutants de Kroxβ0 sont d’utilité limitée à cause de la courte durée de vie des animaux (Topilko et al., 1994 ; Le et al., 2005a). Cette lethalité est probablement due à des défauts de l’activité de Kroxβ0 dans d’autres tissus, particulièrement dans le tronc cérébral où l’inactivation de Kroxβ0 entraine une perturbation du rythme respiratoire (Jacquin et al., 1996 ; Chatonnet et al., 2002). Pour contourner ce problème, Decker et al., 2006 ont généré une mutation ne permettant que la seule transitoire expression de Krox20. Une telle mutation peut ne pas affecter considérablement les tissus dans lesquels le gène est normalement exprimé transitoirement comme le « hinbrain ». En revanche, si l’expression de Kroxβ0 est constamment requise pour

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la myélinisation des cellules de Schwann, ce type de mutation entrainerait un phénotype similaire à celle de « nul mutation ». Pour obtenir une mutation retardée, ils ont utilisé deux allèles de Krox20 precédemment developpés, Krox20Cre (Voiculescu et al., 2000) et Krox20flox

(Taillebourg et al., β00β). L’allèle Kroxβ0Cre consiste en l’insertion du gène de la Cre recombinase dans le locus Krox20 entrainant une inactivation de Krox20 et l’expression du gène Cre avec un modèle qui recapitule fidèlement le rythme normal de Krox20 (Voiculescu et al., β000). Dans l’allèle Kroxβ0flox, le deuxième exon de Krox20 est flanqué par les sites loxP. Cet allèle se comporte comme le type sauvage mais l’excision de l’exon floxé par la recombinase Cre entraine une inactivation de Krox20 (Taillebourg et al., 2002).

Dans les cellules de Schwann myelinisantes provenant d’animaux hétérozygotes Krox20Cre/flox, Kroxβ0 devrait être exprimé à partir de l’allèle floxé jusqu’à ce que la recombinase Cre s’accumule suffisamment pour conduire à l’inactivation du gène. En suivant l’excision de l’exon floxé par analyse PCR de l’ADN extrait d’échantillon de nerf postnatal1 (P1), P4 et Pβ8 a montré que l’excision avait déjà été initiée à P1 et a progressé avec le temps affectant plus de la moitié des cellules à P4 bien qu’il n’atteint pas l’exhaustivité à Pβ8. Il en resulte probablement de la présence de cellules de Schwann non myelinisantes et d’autres cellules comme les fibroblastes qui n’expriment pas Kroxβ0. L’inactivation du gène dans des cellules de Schwann est corrélée avec une perte progressive de la protéine Krox20.

Les animaux Krox20Cre/flox survivent jusqu’à six 6 semaines. Ils sont tous plus petits que les contrôles (type sauvage Krox20Cre/+ , Krox20flox/+) avec une reduction du poids corporel de l’ordre de β5 à 50%. En plus, les mutants Kroxβ0Cre/flox affichaient un phénotype spécifique impliquant des frissons et une altération de la coordination de la marche. Chez les animaux mutants d’âge compris entre 4 et 6 semaines, l’examen des semi fines du nerf sciatique et l’analyse électromicroscopique a revelé une absence complète de la gaine de myéline malgré une densité normale axonale. Aucune infiltration de macrophage ou de bulbe d’oignon de cellules de Schwann n’était observée mais un développement extensif, concentrique des membranes basales était frequemment trouvé autour des axones. En plus, le cytoplasme axonal des mutants contenait une densité élevée de mitochondrie, de microtubules et de neurofilaments par rapport aux contrôles, suggerant que le déficit de la myéline a entrainé des perturbations axonales.

Les analyses démontrent que les nerfs des mutants Krox20Cre/flox ne sont pas myélinisés chez les adultes et pose la question à savoir si une myélinisation a-t-elle lieu au cours du développement postnatal. Pour repondre à cette question, des sections de nerf sciatique à P4 ont été analysées en microscopie électronique. Les animaux de type sauvage présentent beaucoup

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de myéline fine alors que les mutants Krox20Cre/flox sont presque complètement amyéliniques. Les tentatives de myélinisation ont été suggérées par l’observation des axones dénudés aux mesaxones initiant le processus d’enroulement mais seulement peu de fibres de myeline généralement pas bien compactées auraient été observé chez les mutants. Une analyse similaire réalisée sur des P12 a revélé une absence complète de gaine de myéline. Ces résultats suggèrent que l’initiation de la myélinisation a très rarement lieu chez les mutants mais s’il a lieu, un processus d’avortement de myélinisation suit.

Il existe une contradiction apparente entre la cinétique de mise en place de bloc de la myélinisation des cellules de Schwann et la perte partielle de l’allèle floxé et la protéine Krox20 avec seulement presqu’une double réduction à P4. Une possible explication est que la persistence de l’allèle floxé non excisé est causée par une prolifération intense au cours de la période périnatale des cellules de Schwann immatures qui n’ont pas encore activé Kroxβ0. Une proportion significative de ces cellules peut en permanence tenter de s’engager dans la myélinisation, exprimant Krox20 et donc de maintenir un certain niveau de protéine dans le nerf. Cependant, ces cellules qui rapidement inactivent le gène ne sont pas capables de procéder à une entrée dans la voie de la myélinisation.

Ces résultats indiquent que l’inactivation retardée de Kroxβ0 entrainent une

amyélinisation péripherique et que ce phénotype est maintenu à partir de la naissance jusqu’à au moins six semaines, suggérant que l’inactivation de Krox20 empêche définitivement la myélinisation contrairement au « knock-out » SCIP/Oct6 (Jaegle et al., 1996).