L’électrophorèse capillaire et le non-SELEX :

Avec la méthode non-SELEX, on élimine l’étape intermédiaire d’amplification par PCR entre chaque cycle de sélection (Figure 2-19). Cette méthode est une variante dérivée de la méthode

CE-SELEX qui implique plusieurs étapes répétitives de séparation par électrophorèse capillaire sans étape intermédiaire d’amplification par PCR entre chaque cycle de sélection. C’est en 2006, que Berezovski et son équipe ont utilisé cette méthode pour la première fois en électrophorèse capillaire (108). Ils ont ainsi pu sélectionner les aptamères pour la protéine

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hRAS en effectuant 3 cycles de sélection par électrophorèse capillaire sans étape d’amplification par PCR entre les séparations.

Figure 2-19 : Comparaison entre la méthode SELEX où plusieurs cycles de séparation et d'amplification sont réalisés et le non-SELEX ou plusieurs cycles de séparations sans amplification sont réalisés. Issu de (108).

Un mélange de banque d’ADN et de molécules cibles est injectée par électrophorèse capillaire. Comme la quantité injectée est faible, la diversité du nombre de molécules d’ADN est plus faible en comparaison avec la méthode SELEX conventionnelle. Pour remédier à cela, l’équipe de Li (109) a optimisé les conditions d’injection en utilisant des capillaires de diamètre interne de 100µm. En augmentant le diamètre interne du capillaire, le volume d’injection est plus important (411 nL avec un capillaire de 100µm au lieu de 150nL avec un capillaire de 75µm) et donc le nombre de molécules injectées également (1013 _{molécules avec un capillaire de}

100µm de diamètre et 2*1012 _{molécules avec un capillaire de 75µm de diamètre) (Figure 2-20).}

Figure 2-20 : Optimisation du volume du capillaire et donc du nombre de séquences injectées dans la méthode CE/non- SELEX. (a) Diamètre de 100µm, (b) diamètre de 75 µm, (c) diamètre 50µm. Tampon de migration : tris (hydroxyamino) methane-glycine-potassium 3X, 333Vcm-1_{, [ADN]= 50µM, injection 1 psi, 13s. Détection UV à 260 nm Issu de (109).}

La fraction contenant le complexe [ADN.cible] est ensuite collectée dans un flacon contenant quelques microlitres de la protéine (5µL de protéine hRAS, 30µL de bovine catalase). Puis ce mélange est de nouveau injecté par électrophorèse capillaire et soumis à une seconde séparation. Une nouvelle fraction est de nouveau collectée, incubée avec la protéine contenue dans le flacon de collecte et ce mélange est réinjecté (Figure 2-21). Dans le cas de la protéine h-RAS, le calcul

de la constante de dissociation KD a été effectué pour chaque fraction collectée et l’affinité au

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Figure 2-21 : Protocole de sélection d'aptamères par non-SELEX avec trois étapes d'injections Issu de (108).

Le mode de stockage des composés est aussi un paramètre important. Lors de la sélection d’aptamères pour les protéines de transduction du signal, les fractions collectées ont été stockées à -20°C avant leurs analyses (110). En fonction du type de protéines, les conditions de stockages et d’incubations varient. Pour les protéines de transduction du signal, des temps d’incubation d’une heure ont été utilisés à température ambiante afin d’assurer une forte stringence du processus de sélection ou seuls les aptamères qui peuvent se lier rapidement donc avec une sélectivité élevée ont été sélectionnés. Mais les temps d’incubation plus court (tincubation

= 30min dans le cas de la sélection des aptamères pour la bovine catalase) permettent de maintenir l’activité de la protéine et de s’assurer que l’on sélectionne des aptamères se liant à la protéine et non des impuretés. Une autre approche a été proposée encore par l’équipe de Li (111) où une étape préliminaire de séparation sur filtre de nitrocellulose a lieu avant d’effectuer la séparation CE/ non-SELEX. Grâce à cette étape, cette méthode leur permet d’éliminer toutes les molécules d’ADN qui ne se lient pas à la cible, et qui sont retenues sur le filtre. Ils ont ainsi passé au crible, 1015 _{molécules, ce qui a permis de réduire la complexité de la banque d’ADN.}

Une des contraintes de cette méthode est qu’il faut tenir compte du facteur de dilution désigné par ƒ= (Ltotale / Ldétecteur) * tmigration du complexe, où Ltotale est la longueur totale du capillaire et Ldétecteur

la longueur du capillaire depuis l’entrée de l’injection jusqu’à la fenêtre de détection. tmigration du complexe représente le temps de migration du complexe et grâce à ce calcul, ils peuvent déterminer

à quel moment la fraction de complexe sera éluée. Globalement, l’élimination de l’étape de PCR permet néanmoins de réduire considérablement le temps requis pour obtenir des aptamères puisque c’est cette étape qui est la plus longue du processus (112). En utilisant la méthode appelée NECEEM based non-SELEX, la sélection n’a duré qu’une heure et l’affinité de la protéine à l’aptamère est 4 fois plus importante dans le cas de la protéine hRAS. Enfin présentons un travail original conduit par Fiore et al (113). Les auteurs ont développé un

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système de deux aptamères capables de se fixer en sandwich à l'Adénosine. L'un de ces aptamères est fluorescent tandis que l'autre est modifié en 5' par une fonction cholestérol. Une modification de la mobilité de ce dernier peut être ajustée lorsque le tampon de séparation en CE contient un tensio-actif. Ainsi deux types de séparation rapide utilisant comme tensio-actif neutre le Brij 35, sont conduites et permettent de séparer le complexe sandwich et les réactifs seuls. Le premier type de séparation ressemble grandement aux résultats du NECEEM, dont on sait que sa limite repose sur la dissociation du complexe durant la séparation en CE. Pour le deuxième type de séparation, les auteurs ajustent le flux électroosmotique afin qu'il permette de diriger le complexe (qui détient la partie cholestérol) et l'aptamère fluorescent non lié en sens opposé l'un de l'autre. Les auteurs collectent ainsi les complexes générés. La qPCR avec les amorces correspondant à l'aptamère fluorescent permet de vérifier que le complexe a bien été collecté et de doser son abondance en fonction de la quantité d'adénosine utilisé.