Chapitre 1 : L’électrophorèse capillaire et l’utilisation de la double détection UV LEDIF pour
2.2 Caractérisation de l’aptamère T29 et du complexe T29.Thrombine par électrophorèse
2.2.1 Avec un capillaire en PVA
L’aptamère T29 est greffé à un fluorophore en position 5’ de ce dernier. Le fluorophore utilisé est le 6-carboxyfluorescéine (6-FAM).
FAM-5’AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGAC3’
Ainsi, grâce au greffage d’un marqueur fluorescent, on peut détecter l’aptamère T29 (Figure 2- 3), mais également le complexe [T29. Thrombine] lorsque l’on injecte le mélange
T29.thrombine. Dans un premier temps, nous avons caractérisé la détection du T29, en utilisant un capillaire en PVA.
Figure 2-3 : Détection de l'aptamère T29 à 50 nM par fluorescence à 488 nm. Capillaire en PVA - diamètre : 50 µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l=21 cm). Tm=2.2 min. Tampon de séparation : Phosphate de sodium dibasique pH= 8.2. Injection : 50 mBAR, 30 s. Séparation : -30 kV
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Dans ces conditions, lorsque nous avons voulu réaliser le complexe T29.thrombine, nous n’avons pas observé le pic de complexe. L’analyse du complexe T29 50 nM + Thrombine 500 nM, nous a donné un électrophérogramme (Figure 2-4), pour lequel nous observions une
diminution de la fluorescence du pic d’aptamère libre (HT29 complexé= 0.05 RFU et HT29 libre = 0.2
RFU)
Figure 2-4: Analyse du complexe T29 50 nM + thrombine 500 nM par fluorescence à 488 nm. Capillaire en PVA - diamètre : 50 µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l=21 cm). Tm=12 min. Tampon de séparation : Phosphate de sodium
dibasique 50 mM pH= 8.2. Injection : 50 mBAR, 30s. Séparation : -30 kV
Cette observation peut traduire le fait que le complexe injecté serait instable au cours de la séparation dans le capillaire, et donc le complexe [T29. Thrombine] se dissocierait au cours de la migration. Cela aboutirait à une mauvaise séparation et la traînée observée (Figure 2-4).
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons décidé d’inverser le sens d’injection du complexe [T29 + thrombine] afin de raccourcir la longueur du trajet de séparation dans le capillaire et donc le temps de migration du complexe (Figure 2-5). Pour pouvoir réaliser cette méthode, il
faut veiller à ce que l’électrode côté injection soit au pôle négatif.
Figure 2-5: Analyse du complexe T29 50 nM + thrombine 500 nM par fluorescence à 488 nm. Capillaire en PVA - diamètre : 50 µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l=19 cm). TmT29=2.2 min. Tmcomplexe= 5.8 min. Tampon de séparation
: Phosphate de sodium dibasique 50 mM pH= 8.2. Injection à l’outlet : 50 mBAR, 30 s. Séparation : +30 kV
Avec un capillaire en PVA, le revêtement diminue de façon importante le flux électroosmotique et ce sont les molécules qui ont le rapport (charge/ taille) le plus élevé qui migrent en premier. Donc c’est l’aptamère sous forme non complexé qui migre en premier. En inversant le sens d’injection, le complexe parcourt une distance plus courte avant d’atteindre la fenêtre de détection LIF. Alors qu’il parcourait l= 71 cm et avait un temps de migration de 12 min, en étant injecté à l’outlet, la distance est réduite (l= 19 cm) et le temps de migration de l’aptamère
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libre correspond à celui prévu par le calcul pour une distance effective quatre fois plus courte (t= 3 min). En ce qui concerne le complexe, on observe toujours une dissociation de ce dernier car il n’y a pas de retour à la ligne de base entre le pic d’aptamère libre et celui du complexe. Ainsi pour amoindrir l’effet de la dissociation, nous avons mesuré l’effet de la pression sur la taille du pic du complexe (Figure 2-6). Pour cela, nous avons appliqué une dépression en plus
de la séparation par voltage. Lorsque nous appliquons une dépression de 50 mBar, nous avons une meilleure séparation entre le T29 libre et le complexe. Cependant, bien que la détection et la séparation soient optimales avec une dépression de 50 mBAR, cela pourrait signifier dans le cas de différents aptamères injectés que ceux qui sont détectés à 50 mBAR ont une moins bonne affinité que ceux détectés avec une dépression de 10 mBAR.
Figure 2-6 : Détection du complexe aptamère T29 50 nM + thrombine 500 nM par fluorescence à 488 nm. Capillaire en PVA - diamètre : 50 µm. Longueur totale L = 90 cm (longueur effective l=21 cm). Tampon de séparation : Phosphate de sodium dibasique 50 mM pH= 8.2. Injection à l’OUTLET : 50 mBAR, 30 s. Séparation : +30 kV + pression.
2.2.2 Avec un capillaire en silice
Nous avons décidé de changer de diamètre de capillaire afin d’injecter une plus grande quantité d’ADN. D’après l’article de M.Toulmé, je cite « on peut penser que dans une population présente en quantité importante, se trouvera une séquence adaptée à la reconnaissance de la cible choisie. La coexistence, dans la même entité moléculaire, de la forme et de la séquence permet, par alternance d’une étape de sélection (liée à la forme) et d’amplification (liée à la séquence), d’extraire de la famille, à l’issue d’un processus d’évolution moléculaire, le(s) candidat(s) doué(s) des propriétés attendues » (149). Mais n’ayant pas de capillaire greffés PVA de 100 µm de diamètre, nous avons été obligés d’utiliser un capillaire en silice nue de diamètre 100 µm. Dans un premier temps, les conditions de séparation ont été optimisées en utilisant un capillaire de diamètre 50 µm (Figure 2-7).
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Figure 2-7 : Détection de l'aptamère T29 à 100 nM par fluorescence à 488 nm. Capillaire en silice - diamètre : 50µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l=21 cm). Tm=18 min. Tampon de séparation : Phosphate de sodium dibasique 50 mM pH= 8.2. Injection : 50 mBAR, 30 s. Séparation : + 20 kV, + pression 5 mBAR.
Les conditions de séparation + 20 kV, + pression 5 mBAR, sont différentes par rapport aux conditions utilisées pour injecter la thrombine et l’aptamère T29 (+ 30 kV) avec différentes pressions. Avec un capillaire de diamètre 100 µm, l’échauffement de ce dernier si l’on applique un voltage de + 30kV serait trop important (I > 80µA), ce qui pourrait nuire à la répétabilité de la séparation.
Nous avons ensuite réalisé l’interaction entre l’aptamère T29 à 50 nM et la thrombine à 100 nM (Figure 2-8). Avec un capillaire en silice, nous modifions la nature du capillaire et la manière
d’injecter et ce sont les molécules qui ont le rapport (masse/ charge) le plus faible qui migrent en premier. Donc le complexe migre en premier suivi de l’aptamère sous forme libre.
Figure 2-8 : Analyse de l'aptamère T29 100 nM (électrophérogramme en rouge) et du complexe T29 50 nM + thrombine 100 nM (électrophérogramme bleu). L'aptamère a un temps de migration de 18.1 min et le complexe migre à t= 11.7 min. Capillaire en silice - diamètre : 50 µm. Longueur totale L= 90 cm (longueur effective l= 21 cm). Tm= 18 min. Tampon de séparation : Phosphate de sodium dibasique 50 mM pH= 8.2. Injection : 50 mBAR, 30 s. Séparation : + 20 kV, + pression 5 mBAR.
Nous avons également mesuré l’effet de la pression sur la séparation du complexe avec un capillaire en silice. Pour cela, nous avons injecté le complexe [T29. Thrombine] à différentes pressions (Figure 2-9).
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Ainsi, nous montrons l'influence de la pression sur l'efficacité de la séparation du complexe T29.thrombine. Sans pression, les aptamères peuvent être choisis avec un koff plus lent avec une
meilleure séparation entre le complexe et le T29 libre. En revanche, plus la pression augmente, moins la séparation entre le complexe et le T29 libre est atteinte. Cependant, là aussi, le signal du complexe augmente avec une pression plus élevée et conduit ainsi à une détection plus élevée de ce dernier.