Justification des choix techniques

3.1.1.1. Choix des tests fonctionnels de la réparation des CDB

Depuis les années 90, trois grandes approches ont été adoptées pour déterminer les bases moléculaires de la radiosensibilité (Choi, Hong et al. β015).

 L’approche génomique, qui consiste à déterminer, par la connaissance des séquences des gènes, certaines mutations qui seraient associées à une radiosensibilité anormale. C’est le cas de la recherche des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ;

 L’approche protéomique, qui consiste à déterminer, par l’étude de l’expression des gènes, des protéines dont la régulation conditionnerait la réponse aux radiations ;  L’approche fonctionnelle, qui consiste à déterminer, par l’analyse

phénoménologique des anomalies des réponses moléculaires à l’irradiation, quelles fonctions biochimiques peuvent être déficientes et partant, comment certaines protéines peuvent être impliquées dans la radiosensibilité.

Comme on l’a vu plus haut, des données de la littérature de plus en plus nombreuses montrent que les CDB sont les dommages de l'ADN les mieux corrélés à la létalité cellulaire et à la toxicité - si elles ne sont pas réparées - et à l'instabilité génomique et au risque de cancer - si elles sont mal réparées (Jeggo and Lobrich β007, Granzotto, Joubert et al. β011). Etablie à l’origine pour les CDB radio-induites, une telle conclusion semble être aussi valable pour tous les agents cassants de l’ADN. Dès lors, une évaluation du risque toxique et cancérogène basée sur la quantification des CDB et l’étude des dysfonctionnements de leurs voies de réparation apparaît donc comme logique. Outre les conclusions de la littérature, ces éléments se basent sur trois constats essentiels :

o La très grande majorité des syndromes associés à une hyper-radiosensibilité significative sont causés par la mutation de protéines impliquées dans la réparation et la signalisation des CDB (On verra

cependant plus loin que l’étude des exceptions à cette observation est à l’origine du modèle du transit cyto-nucléaire d’ATM).

o Les CDB sont à l’origine des cassures chromosomiques, événements cytogénétiques dont l’implication dans la létalité ou la transformation cellulaire fait consensus.

o De tous les dommages radioinduits de l’ADN, les CDB sont les seules dont l’induction et/ou le rythme de réparation sont modulés, comme la radiosensibilité, par l’oxygénation, l’hyperthermie, ou le transfert d’énergie linéique de l’irradiation (Joubert, Vogin et al. β011).

En dépit de ces arguments, la facilité des expériences de génomique ou de protéomique (notamment expliquée par leur rapidité et leur simplicité) a occulté l’intérêt des tests fonctionnels concernant les CDB dans la détection des anomalies de la radiosensibilité. D’ailleurs, ces derniers devenaient de moins en moins accessibles car leur mise en place fait souvent appel à un « savoir-faire » technique important. En parallèle, et en ne suivant guère de logique les tests apoptotiques à partir de lymphocytes devenaient également populaires en dépit d’artéfacts techniques rédhibitoires qui ne se révélèrent que très récemment (Steel 199γ, Joubert and Foray β006, Granzotto, Joubert et al. β011). L’approche du laboratoire, délibérément basée sur des tests fonctionnels de la réparation et de la signalisation des CDB ne pouvait apparaitre que comme une démarche à contre-courant des modes actuels.

3.1.1.2. Choix des modèles cellulaires

Les données radiobiologiques (non-épidémiologiques) qui constituent la base des règles de radioprotection sont issues de modèles animaux. Les modèles moléculaires mécanistiques de la réparation des dommages radio induits, du contrôle du cycle ou de la mort cellulaire sont essentiellement étayés par des données issues de modèle animaux et le développement des recherches depuis ces β0 dernières années n’a pas démenti ce constat. Pourtant, l’usage de modèles animaux en radiobiologie peut être facilement contesté par au moins deux arguments :

 L’homologie de séquence et encore moins l’homologie fonctionnelle des gènes des espèces animales sont loin d’être vérifiées avec les gènes humains correspondants. D’ailleurs, l’homologie des gènes entre espèces est généralement basée sur une simple affirmation d’un groupe d’auteurs à partir de l’existence de certains domaines

en commun voire identique. L’exemple représentatif est le gène brca1 du rongeur qui n’a que 58% d’identité avec le gène humain BRCA1. La mutation de brca1 chez le rongeur ne conduit à aucune prédisposition au cancer mammaire alors que chez l’homme, les mutations hétérozygotes BRCA1+/- augmentent d’un facteur 6 à 10 le risque de cancer du sein. (Bennett, Brownlee et al. 1999, Joubert, Vogin et al. β011).  La taille du noyau des modèles cellulaires animaux est généralement inférieure à la

taille d’un noyau humain. Par voie de conséquence, la cible étant plus petite, les animaux sont plus radiorésistants que l’homme (ex : la dose létale moyenne est de 15 Gy chez le rat alors qu’elle est de 4,5 Gy chez l’homme). Ainsi, toutes les courbes effet-dose et les valeurs de seuil sont différentes suivant les espèces et le passage de l’une à l’autre ne suit pas une loi forcément linéaire.

Ainsi, en dépit des difficultés pratiques de culture cellulaire, le laboratoire d’accueil a délibérément choisi de n’utiliser que des cellules humaines non-transformées. Par contre, le choix pouvait se porter sur les lymphocytes ou les fibroblastes de peau. Là encore, l’argumentation devait être rigoureuse :

 Durée de vie en culture : les lymphocytes ont une durée de vie limitée en culture, ce qui pousse généralement les laboratoires à les immortaliser par le virus Epstein-Barr (EBV) dont l’effet peut conduire à une modification drastique d’un grand nombre de fonctions géniques et à une plus grande radiorésistance. A l’inverse, les fibroblastes de peau sont plus résistants en culture (une vingtaine de passages sont possibles) et ils supportent mieux la conservation dans l’azote liquide.

 Contribution de la mort par apoptose : comme on l’a mentionné plus haut, l’apoptose n’est pas la mort prépondérante en radiobiologie. Par contre, c’est la mort majoritaire pour le cas particulier des lymphocytes. C’est pourquoi ce type particulier de cellules peut ne pas être représentatif de la réponse aux radiations, avec en plus, le risque d’artéfact technique dû à la production de CDB au cours du processus apoptotique et non immédiatement après l’irradiation.

 Cycle cellulaire : les fibroblastes se mettent naturellement en phase de plateau (quiescence ou G0/G1) grâce à la propriété d’inhibition de contact qui garantit l’homéostasie. Ce n’est pas le cas des lymphocytes qui peuvent évoluer dans le cycle et donc ne pas former une population homogène de cellules.

 Représentativité : en plus des spécificités évoquées ci-dessus, on peut s’interroger sur la vraie représentativité des lymphocytes pour une réponse aux radiations qui va surtout provoquer l’inflammation du tissu conjonctif. En effet, dermites et rectites peuvent-elles être fidèlement prédites par l’analyse de la réponse des lymphocytes qui, par la taille de leur noyau et de leur cytoplasme, n’ont pas la même radiosensibilité que des fibroblastes ?

 Le laboratoire d’accueil se focalise donc depuis sa création sur la réponse aux radiations de fibroblastes humains non-transformés en phase de plateau. Là encore, cette démarche qui a beaucoup de contraintes, est à contre-courant de la pratique d’autres laboratoires qui favorisent l’utilisation de lignées qui poussent très rapidement mais sans s’assurer de contrôler les artéfacts causés par les facteurs évoqués ici (Granzotto, Joubert et al. β011). Ces choix ont été illustrés et argumentés entre le laboratoire et le clinicien dans la publication suivante Individual response

to ionising radiation: What predictive assay(s) to choose ? C R Biol. 2011 Feb;334(2):140-57. doi: 10.1016/j.crvi.2010.12.018.