IV. Conditions de culture

I.2.IV.1. Pré-culture en Erlenmeyer

Les pré-cultures sont effectuées dans des Erlenmeyers de 500 mL contenant 100 mL de milieu MS (soit 20% volume liquide/volume total). Chaque Erlenmeyer est inoculé avec 300 µL de suspension de spores donnant une concentration initiale de 1,2.10⁶ spores/mL. Les pré-cultures sont ensuite incubées à 30°C sous une agitation orbitale de 250 rpm pendant 48h.

I.2.IV.2. Culture en fermenteur

I.2.IV.2.1. Description des fermenteurs BioFlo 110 (New Brunswick Scientific Co., Inc.)

Les cultures sont réalisées dans quatre fermenteurs BioFlo 110 (New Brunswick Scientific Co., Inc.) de 2L de volume utile, équipés de différents modules (figures .2.1 et .2.2).

 L’arbre d’agitation est composé de deux turbines de type Rushton d’un diamètre de 5 cm. L’arbre est connecté par accouplement magnétique à un moteur d’agitation de type Magmator. Des contre-pales sont placées à l’intérieur du fermenteur afin d’éviter la formation d’un flux tangentiel sous forme de vortex.

 _{La température à l’intérieur du fermenteur est mesurée à l’aide d’un thermocouple}

métallique placé dans un doigt de gant. Le système de régulation est composé d’une couverture chauffante et d’une électrovanne contrôlant la circulation du liquide de refroidissement dans un serpentin plongeant dans le réacteur.

 La canne de prélèvement plonge au fond du réacteur. Elle est reliée à une seringue permettant de réaliser des prélèvements de manière stérile par aspiration, l’environnement aseptique est assuré par un bec Bunsen.

 _{Le dispositif d’aération comporte un débitmètre massique (Brooks Instrument, modèle}

5850TR), un filtre à gaz stérilisable en entrée du fermenteur relié à une canne d’aération (diffuseur) plongeant au fond du réacteur sous la turbine basse.

 Une sonde stérilisable (Mettler Toledo) permet de mesurer la pression partielle en oxygène dissous. Le résultat est donné en pourcentage de la saturation du milieu liquide en oxygène dissous. La pression partielle en oxygène dissous peut être régulée automatiquement via une cascade d’agitation et manuellement par l’augmentation du débit d’air en entrée du fermenteur.

 Le pH du milieu est mesuré par une sonde à immersion stérilisable (Mettler Toledo). Le pH est contrôlé par un système stérile d’ajout de solutions acide et basique à l’aide de pompes péristaltiques.

 Un condenseur à eau est placé à la sortie du fermenteur pour éviter des pertes importantes de produits volatils durant les fermentations. La sortie est reliée à un analyseur de gaz (Servomex, Xentra 4100). Ce dernier permet la mesure des fractions molaires en dioxygène et en dioxyde de carbone dans le gaz de sortie du fermenteur. Avant analyse le gaz est séché par un déshumidificateur à effet Peltier. Ensuite, le dioxyde de carbone est dosé par infrarouge et un analyseur paramagnétique est utilisé pour quantifier le dioxygène.

Les fermenteurs sont reliés à une unité de commande contrôlée par le logiciel BioCommand Plus (Bioprocessing Software, New Brunswick Scientific Co., Inc.). Cette unité permet le contrôle et l’acquisition simultanés des données de quatre fermenteurs et de l’analyseur de gaz.

Figure .2.1 : Schéma des fermenteurs BioFlo 110 (New Brunswick Scientific Co., Inc.)

0 I

Nom Valeur Consigne Control Temp 30 30°C Auto Agit 150 150 rpm pO2 PumpA0 0% Off PumpB0 0 % Off pH 7 7 Auto pO2 75 30% Auto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 Unité de commande

Module de contrôle du niveau

Module de contrôle pH et p0₂

Module de contrôle température et agitation

Module des pompes

NaOH Ac. Acé-tique Air Régulation température 20,06% Oxygène 3,24% CO2 Analyseur de gaz Filtre 0,2 µm Système de prélèvement Filtre 0,2 µm Acquisition Liquide refroidissement 0 I

Nom Valeur Consigne Control Temp 30 30°C Auto Agit 150 150 rpm pO2 PumpA0 0% Off PumpB0 0 % Off pH 7 7 Auto pO2 75 30% Auto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 Unité de commande

Module de contrôle du niveau

Module de contrôle pH et p02

Module de contrôle température et agitation

Module des pompes

NaOH Ac. Acé-tique Air Régulation température 20,06% Oxygène 3,24% CO2 Analyseur de gaz Filtre 0,2 µm Système de prélèvement Filtre 0,2 µm Acquisition Liquide refroidissement 0 I

Nom Valeur Consigne Control Temp 30 30°C Auto Agit 150 150 rpm pO2 PumpA0 0% Off PumpB0 0 % Off pH 7 7 Auto pO2 75 30% Auto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 Unité de commande

Module de contrôle du niveau

Module de contrôle pH et p02

Module de contrôle température et agitation

Module des pompes

NaOH Ac. Acé-tique Air Régulation température 20,06% Oxygène 3,24% CO2 Analyseur de gaz Filtre 0,2 µm Système de prélèvement Filtre 0,2 µm Acquisition Liquide refroidissement

Figure _{.2.2 : Fermentation batch de Sa. algeriensis dans un fermenteur BioFlo 110 (New Brunswick Scientific Co., Inc.),}

photo personnelle

I.2.IV.2.2. Conditions de fermentation standards

Les fermenteurs sont inoculés avec un volume de préculture égal à 5% du volume utile soit 100 mL de préculture dans 2L de milieu. Dans les conditions standards, la température est régulée à 30°C et le pH est maintenu à 7 par ajout d’acide acétique (1N) et d’hydroxyde de sodium (2N). L’agitation initiale est fixée à 150 rpm et le débit d’air en entrée du fermenteur à 0,5 vvm (soit 1L d’air par minute). Le pourcentage d’oxygène dissous est maintenu à un minimum de 30% de la saturation par une cascade sur l’agitation entre 150 et 250 rpm. Si l’augmentation de l’agitation ne permet pas de maintenir l’oxygène dissous à 30%, le débit d’air en entrée du fermenteur est augmenté jusqu’à une valeur maximale de 1 vvm (soit 2L d’air par minute). Pratiquement, le débit d’air n’a été augmenté manuellement que pour l’expérience CL-35°C. Afin de limiter la formation de mousse, un agent antimousse (Rhodorsil 426R) est ajouté en cours de fermentation à environ 50h de culture (environ 10 gouttes).

I.2.IV.2.3. Prélèvement des échantillons

Des échantillons de 20 mL sont effectués grâce au système de prélèvement du fermenteur afin de suivre les cinétiques de croissance, de consommation des substrats et de production de la thiolutine. Chaque échantillon est immédiatement centrifugé à 10 000 g et à 4°C pendant 15 minutes afin de séparer le surnageant de la biomasse. Le surnageant est ensuite stocké à -20°C dans l’attente des analyses. La biomasse est quantifiée selon la méthode décrite au paragraphe I.2.V.1.