L’analyse des résultats expérimentaux nous a amené à introduire dans le gaz de sortie du fermenteur la composition en ammonium gazeux (équation .2.6.3), calculée par équilibre liquide-vapeur (cf. paragraphe I.3.I.2.1).
𝑦𝑠𝑁2= 1 − (𝑦𝑠𝐶𝑂2+ 𝑦𝑠𝑂2+ 𝑦𝑠𝑁𝐻3𝑔) (.2.6.3)
Le bilan matière sur l’entrée et la sortie du fermenteur permet de déterminer les vitesses de production du dioxyde de carbone, de l’ammonium gazeux et de consommation du dioxygène (équations .2.6.4 à .2.6.6). La fraction molaire en ammonium en entrée du fermenteur est supposée nulle. 𝐷𝑒× 𝑦𝑒𝐶𝑂2+𝑑[𝐶𝑂2] 𝑑𝑡 𝑉𝐿= 𝐷𝑠× 𝑦𝑠𝐶𝑂2 (.2.6.4) 𝑑[𝑁𝐻3𝑔] 𝑑𝑡 𝑉𝐿= 𝐷𝑠× 𝑦𝑠𝑁𝐻3𝑔 (.2.6.5) 𝐷𝑒× 𝑦𝑒𝑂2+𝑑[𝑂2] 𝑑𝑡 𝑉𝐿= 𝐷𝑠× 𝑦𝑠𝑂2 (.2.6.6) Où 𝑦𝑒𝑂2 et 𝑦𝑒𝐶𝑂2 représentent respectivement les fractions molaires de l’oxygène et du dioxyde de carbone dans le gaz d’entrée du fermenteur et 𝑦𝑠𝑂2, 𝑦𝑠𝐶𝑂2 et 𝑦𝑠𝑁𝐻3𝑔
les fractions molaires de l’oxygène, du dioxyde de carbone et de l’ammonium dans le gaz en sortie du fermenteur et VL est le volume de liquide dans le fermenteur.
Les quantités molaires cumulées (rétentions molaires) de dioxygène consommé, de dioxyde de carbone et d’ammonium gazeux produit sont ensuite calculées par intégration des vitesses de consommation et de production en utilisant la méthode des trapèzes.
D’après les données du constructeur, les erreurs de mesure sur les fractions molaires en dioxygène et en dioxyde de carbone sont respectivement de 0,8% et 30,0%. Les fractions molaires en dioxyde de carbone mesurées en cours de fermentation varient entre 0,04% et 0,4%, alors que la gamme de mesure de l’analyseur s’étend de 0 à 12%. Nos mesures se situent dans la limite de détection de l’appareil, ce qui explique l’erreur importante sur la mesure des fractions molaires en dioxyde de carbone. Les faibles variations de la fraction molaire en dioxygène en cours de fermentation entre 20,5% et 20,8% induisent une faible précision des données en oxygène. L’erreur engendrée se cumule à chaque pas d’intégration pour le calcul des quantités cumulées. L’erreur sur la fraction molaire de l’ammonium gazeux est supposée égale à celle sur le dosage des ions ammonium puisqu’elle est calculée à partir de ces données.
Les valeurs de la fraction molaire en ammonium gazeux ne sont évaluées que pour les points expérimentaux pour lesquels la concentration en ions ammonium est quantifiée. Le calcul est précisé au paragraphe I.3.I.2.1. L’intégration des vitesses de consommation de l’oxygène et de production du dioxyde de carbone et de l’ammonium est réalisée entre chaque point expérimental (environ toutes les 4 h). Le manque de précision de l’intégration entraine une erreur supplémentaire de 20% sur les quantités cumulées en dioxygène, dioxyde de carbone et ammonium gazeux.
I.2.VII. Récapitulatif des méthodes de quantification des composés
dans le fermenteur
Le tableau .2.10 présente un récapitulatif des composés mesurés dans le fermenteur (milieu liquide + gaz) et utilisés pour la modélisation du comportement de Sa. algeriensis. Pour chaque composé, le type de méthode analytique utilisée pour le dosage ainsi que l’erreur de mesure est rappelée.
Tableau .2.10 : Récapitulatif des méthodes d’estimation des teneurs des composés dans le fermenteur
Composé Type de
mesure
Technique analytique et calcul le cas échéant
Erreur relative de la mesure (%)
Biomasse Directe Poids sec Dépend de la quantité
de biomasse
Acides aminés Indirecte Dosage de l’azote -aminé (méthode
enzymatique) 5,0
Glucose Directe Méthode enzymatique 4,3
Ions
ammonium Directe Méthode enzymatique 4,4
Thiolutine Directe HPLC 4,7
Dioxyde de
carbone Indirecte
Mesure des fractions molaires en O2 et CO2
Bilan entrée/sortie sur le diazote
36,1
Dioxygène Indirecte
Mesure des fractions molaires en O2 et CO2
Bilan entrée/sortie sur le diazote
20,0
Ammonium
gazeux Indirecte
Equilibre acido-basique et de changement de phase de l’ammonium Bilan entrée/sortie sur le diazote
20,5
Pour chaque composé, les écarts-types relatif (𝜎𝑅𝑒𝑙) et absolu (𝜎𝐴𝑏𝑠) sont définis par l’équation .2.7.1.
𝜀 = 𝜎𝑅𝑒𝑙 × 𝑌∗+ 𝜎𝐴𝑏𝑠 (.2.7.1)
Où représente l’erreur de mesure et Y* la valeur vraie de la mesure. Les valeurs des écarts-types des composés dosés dans le milieu de culture sont présentées dans le tableau .2.11. Elles ont été calculées à partir de la mesure à cinq reprises des solutions standard à différentes concentrations, pour les acides aminés (cf. paragraphe I.2.V.2), le glucose (cf. paragraphe I.2.V.4.1), les ions ammoniums (cf. paragraphe I.2.V.3) et la thiolutine (cf. paragraphe I.2.V.5). Pour la biomasse, l’écart-type absolu est calculé à partir de la précision de la balance de 0,1 mg. En effet, le poids sec est calculé par une différence de pesée sur un échantillon de 20 mL (Vp), d’où l’équation .2.7.2.
L’écart-type relatif est supposé égal à l’erreur de mesure sur les échantillons contenant plus de 2 g/L de biomasse car ces échantillons sont pesés dans un nombre maximal de tubes Eppendorf.
𝜎𝐴𝑏𝑠,𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 =0,1√2
𝑉𝑝 1
𝑀𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 (.2.7.2)
Tableau .2.11 : Ecart-type relatif et absolu sur les différents composés du milieu de culture
Composé Ecart-type relatif
(σRel) en % Ecart-type absolu (σAbs) en mmol/L Biomasse 3,06 0,0752 Acides aminés 8,56 0,0018 Glucose 2,16 0,0656 Ions ammonium 3,90 0,0328
I.2.VIII. Analyse de la qualité des données par conservation de la
matière
Les données expérimentales sont les seules sources d’informations « réelles » disponibles lors de l’étude d’un procédé de fermentation. Toutefois, ces mesures expérimentales sont systématiquement entachées d’erreur. Il est donc nécessaire de s’assurer de la fiabilité des mesures obtenues expérimentalement avant leur exploitation. Pour cela, les bilans molaires élémentaires en carbone, azote et degré de réduction sont calculés.
I.2.VIII.1. Calcul des rétentions molaires
Les prélèvements effectués en cours de fermentation, enlève une quantité de chaque composé qui ne pourra donc pas réagir. Afin de ne pas fausser les bilans, il est nécessaire de prendre en compte la quantité de chaque composé prélevée du milieu de culture pour chaque échantillon. Ainsi, la matrice des données expérimentales (Yexp(nmes, nc) en mmol) est calculée par l’équation (.2.8.1) pour le ième prélèvement du jième composé :
𝑛𝑖𝑗= 𝐶𝑖𝑗× 𝑉𝐿𝑖+ ∑𝑖 𝐶𝑘𝑗× 𝑉𝑝
𝑘=1 , 𝑎𝑣𝑒𝑐 𝑖 = 1 … 𝑛𝑚𝑒𝑠 𝑒𝑡 𝑗 = 1 … 𝑛𝑐 (.2.8.1)
Où Cij représente la concentration du jième composé pour le ième prélèvement, VLi le volume de liquide dans le fermenteur à l’instant du ième prélèvement et Vp le volume de chaque prélèvement avec nmes
le nombre d’échantillons et nc le nombre de composés.
Cette méthode à l’avantage de ne pas perdre de carbone ou d’azote dans les prélèvements. Toutefois, elle introduit un biais sur le nombre final de moles des composés. Par exemple, pour une fermentation limitante en ions ammonium, la quantité finale d’ions ammonium ne sera pas nulle et correspondra à la quantité d’ions ammonium présente dans l’ensemble des prélèvements.
I.2.VIII.2. Calcul du volume liquide dans le fermenteur
Le volume du fermenteur à l’instant (t) est calculé en prenant en compte la diminution du volume due à l’évaporation du liquide et à chaque prélèvement (Vp) ainsi que l’augmentation du volume due à l’ajout d’hydroxyde de sodium et d’acide acétique par le système de régulation du pH (équation
.2.8.2). Les débits d’ajout d’acide et de base (dacide et dbase) sont calculés en divisant le volume ajouté au cours de la fermentation par la durée totale de l’ajout pendant la fermentation. Le débit d’évaporation (dévaporation) a été évalué pour une expérience témoin, sans inoculation dans les conditions standards (pH=7, T=30°C, agitation à 150 rpm et débit d’aération à 0,5 vvm). Le milieu de culture est pesé en début et en fin d’expérience. La masse volumique du milieu, prise égale à celle de l’eau, permet d’évaluer le volume de liquide évaporé. Ce volume est ramené à la durée de l’expérience pour calculer le débit d’évaporation supposé constant. Ainsi, 296 mL se sont évaporés en 175h, soit un débit d’évaporation de 1,7 mL/h.
𝑉𝐿(𝑡𝑖) = 𝑉𝐿(𝑡𝑖−1) + 𝑑𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒× (𝑡𝑖− 𝑡𝑖−1) + 𝑑𝑏𝑎𝑠𝑒× (𝑡𝑖− 𝑡𝑖−1) − 𝑑é𝑣𝑎𝑝𝑜𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛× (𝑡𝑖− 𝑡𝑖−1) − 𝑉𝑝
𝑖 = 1 … 𝑛𝑚𝑒𝑠 (.2.8.2)
I.2.VIII.3. Calcul du degré de réduction des composés
Le degré de réduction (d) représente le nombre d’électrons disponibles qui seraient transférés à
l’oxygène lors de l’oxydation totale d’une Cmole du composé en dioxyde de carbone, eau et source d’azote. Pour un composé de formule CHb1Oc1Nd1 en Cmole, avec une source d’azote de formule Ca2Hb2Oc2Nd2, la réaction d’oxydation s’écrirait selon l’équation .2.8.3.
Les bilans élémentaires atomiques (C, H, O, N) permettent de calculer les coefficients stœchiométriques inconnus d’après les équations .2.8.4 à .2.8.7.
Bilan sur N : 𝑛 =𝑑1 𝑑2 (.2.8.4) Bilan sur C : 𝑐 = 1 − 𝑛𝑎2 = 1 −𝑑1 𝑑2𝑎2 (.2.8.5) Bilan sur H : ℎ =12(𝑏1− 𝑛𝑏2) =12(𝑏1−𝑑1 𝑑2𝑏2) (.2.8.6) Bilan sur O : 𝑜 =12(2𝑐 + 𝑛𝑐2+ ℎ − 𝑐1) =14(4 + 𝑏1− 2𝑐1−𝑑1 𝑑2(4𝑎2+ 𝑏2− 2𝑐2)) (.2.8.7) Comme le dioxygène (O2) correspond au transfert de 4 électrons, le nombre d’électrons transférés par le composé de formule CHb1Oc1Nd1 à l’oxygène pendant cette oxydation peut être calculé par l’équation .2.8.8.
𝛾𝑑1= 4𝑜 = 4 + 𝑏1− 2𝑐1−𝑑1
𝑑2(4𝑎2+ 𝑏2− 2𝑐2) (.2.8.8) Par convention, le degré de réduction est nul pour l’eau, la source d’azote et le dioxyde de carbone et celui du dioxygène est de -4.
I.2.VIII.4. Calcul des bilans azote, carbone et redox
Pour chaque prélèvement, la concentration de chaque composé est prise en compte. Les bilans molaires élémentaires sont définis par l’équation .2.8.9.
𝐵 = 𝑌𝑒𝑥𝑝× 𝑆𝑇 (.2.8.9)
Où B(nmes,nel) représente la matrice des bilans et S(nel,nc) la matrice des décompositions élémentaires des composés avec nel le nombre de bilan calculé égal à 3 (carbone, azote et redox).
Pour nos fermentations, la matrice des décompositions élémentaires des composés est donnée par le tableau .2.12.
Tableau .2.12 : Matrice des décompositions élémentaires (S) des composés du fermenteur
Biomasse Acides aminés Glucose Ions
ammonium Thiolutine Dioxyde de carbone Dioxygène C 3,82 4,73 6 0 8 1 0 N 0,8 1,26 0 1 2 0 0 4,15 4,23 4 0 3,75 0 -4 Ammonium gazeux Acides aminés adsorbés Ions ammonium adsorbés C 0 4,73 0 N 1 1,26 1 0 4,23 0
L’erreur sur les bilans est la racine carrée de la somme des carrés des erreurs de chacun des composés pris en compte dans le calcul du bilan (j) pondérées par leur contribution dans le bilan (équation .2.8.10).
∆𝐵𝑖𝑙𝑎𝑛 (𝑡) = √∑𝑛𝑐 (𝑢𝑗× 𝑛𝑗(𝑡) × 𝑠𝑗)2
𝑗=1 (.2.8.10) Où uj représente l’erreur de mesure sur le jème composé, nj la quantité du jème composé à l’instant (t) en mmol et sj le nombre d’élément carbone, azote ou le degré de réduction du jème composé.
I.2.IX. Réconciliation des données expérimentales
Le calcul des bilans carbone, azote et redox permet de détecter les échantillons suspects présentant de « grosses » erreurs. Toutefois, ce calcul ne permet pas de déterminer quel composé est responsable de l’erreur. De plus, l’utilisation des données expérimentales pour la modélisation du système étudié demande une analyse plus fine des erreurs de mesure afin d’obtenir des jeux de données satisfaisant exactement les contraintes sur les bilans atomiques. Ainsi, la réconciliation des données est un moyen efficace de répondre à ces problématiques.
La méthode utilisée pour la réconciliation des données, décrite par Fillon (1996), permet de détecter les grandes erreurs de mesure et de proposer une correction à ces erreurs. La cohérence des données expérimentales est évaluée par rapport à une contrainte mathématique (modèle), dans notre cas les bilans azote, carbone et redox. Cette méthode repose sur trois tests statistiques : GLR (Generalized Likehood Ratio), IMT (Iterative Measurement Test) et RC (Residual Criterion).
I.2.IX.1. Formulation du problème
Les contraintes linéaires peuvent être écrites sous forme matricielle (A (nmesxnel, nc)), d’après le vecteur des mesures vraies (Y*), selon l’équation .2.9.1.
𝐴 𝑌𝑇 ∗= 0 (.2.9.1)
Dans le cas où les erreurs de mesure sont uniquement de type aléatoire, le vecteur des erreurs de mesure (ε) suit une loi normale centrée en 0. Les données mesurées suivent alors une loi normale centrée de variance (V). Les variances sont calculées à partir des erreurs relatives pour chaque composé mesuré. On peut définir le vecteur des mesures (Yexp) par l’équation .2.9.2.
𝑌𝑒𝑥𝑝 = 𝑌∗+ 𝜀 (.2.9.2) Avec, 𝜀 ≈ 𝑁(0, 𝑉) et 𝑌𝑒𝑥𝑝≈ 𝑁(𝑌∗, 𝑉)
La fonction de vraisemblance de Yexp (Fv(Yexp)) donne la probabilité d’obtenir la mesure Yexp à Y* connue (équation .2.9.3).
𝐹𝑣(𝑌𝑒𝑥𝑝) = 1
√2𝜋 𝑑𝑒𝑡𝑉exp (−0,5 (𝑌𝑇 𝑒𝑥𝑝− 𝑌∗)𝑉−1(𝑌𝑒𝑥𝑝− 𝑌∗)) (.2.9.3) La meilleure estimation (Y̅) des mesures vraies (Y*), au sens du maximum de vraisemblance est celle qui maximise Fv en respectant les contraintes (A). Le problème d’optimisation prend la forme suivante (équation .2.9.4).
𝑃 {min𝑌[(𝑌𝑒𝑥𝑝− 𝑌∗)𝑉−1(𝑌𝑒𝑥𝑝− 𝑌∗)]
𝐴𝑋 = 0 (.2.9.4)
Ce problème admet une solution analytique (Y̅) calculée selon l’équation .2.9.5.
Les corrections apportées aux données expérimentales dans le chapitre .3 imposent plusieurs nouvelles contraintes au problème de réconciliation.
Les rétentions molaires de l’ammonium gazeux sont calculées à partir des concentrations en ions ammonium elles-mêmes déduites des rétentions molaires en ions ammonium, d’après le modèle thermodynamique décrit au chapitre .3,
Les rétentions molaires en ions ammonium et en acides aminés adsorbés sont proportionnelles à celles de la biomasse (équation .2.9.6 et .2.9.7),
𝑌𝑖,𝑁𝐻
4,𝑎𝑑+ = 0,174 𝑌𝑋, avec i = 1 … nmes (.2.9.6)
𝑌𝑖,𝐴𝐴𝑎𝑑 = 0,044 𝑌𝑋, avec i = 1 … nmes (.2.9.7)
I.2.IX.2. Description des tests statistiques
Le test GLR, proposé par Narasimhan and Mah (1987), est un test à priori, c’est-à-dire qu’il s’appuie sur le modèle et les mesures seulement pour localiser l’erreur. Ce test est basé sur le calcul du maximum de vraisemblance. Il permet la détection de la mesure erronée au sein de l’échantillon suspect mais également il propose une estimation du biais détecté. Il est ainsi possible de corriger l’erreur et de conserver l’échantillon si la correction proposée est cohérente.
Les deux autres tests utilisés sont des tests a posteriori, et s’appuient sur le résultat de la réconciliation. Dans les deux cas, ils permettent la détection de l’échantillon erroné mais pas de la mesure aberrante. Le test IMT utilise une méthode locale d’estimation de l’erreur entre la valeur de la mesure et la valeur calculée par la réconciliation. Cette méthode est basée sur le calcul du vecteur normalisé des termes correctifs. Le test RC est un test de type global, basé sur l’analyse du critère résiduel de chaque prélèvement i.
Comme tout test statistique, aucun de ces tests n’est parfaitement fiable. Dans le but de rendre la méthode de détection des échantillons suspects plus fiable, les trois tests présentés ici sont associés. Un échantillon est déclaré erroné s’il est détecté par au moins deux des trois tests. Le cas échéant, les mesures suspectes de l’échantillon sont corrigées à partir du biais proposé par le test GLR (𝑏̅) selon l’équation .2.9.8. Si l’échantillon corrigé n’est plus détecté comme erroné il est validé, sinon il est rejeté.
𝑌𝑒𝑥𝑝𝑐 = 𝑌𝑒𝑥𝑝− 𝑏̅ (.2.9.8)
Où Yexp est le vecteur des données expérimentales et Yexpc le vecteur des mesures corrigées par le GLR.