Le séquençage du génome humain a, depuis maintenant quelques décennies, ouvert la porte à de nouvelles stratégies thérapeutiques, telles que la thérapie génique, pour traiter des maladies considérées comme incurables. La thérapie génique est une approche de traitement potentielle pour un vaste éventail de pathologies, qu’elles soient héréditaires ou acquises. Il s’agit d’un procédé fondé sur l'introduction de matériel génétique chez un patient, afin d'insérer un allèle fonctionnel du ou des gènes déficients responsables de sa maladie, ou de modifier l'expression du ou des gènes délétères impliqués dans sa pathologie (Naldini, 2009). La livraison d’acide nucléique repose sur deux composantes principales : la première est que le matériel génétique doit pouvoir être exprimé à l'endroit voulu et la seconde est que le matériel génétique utilise un système de livraison efficace et sûr, jusqu'aux cellules cibles. Ce dernier point correspond au thème principal de ce projet de Doctorat, à savoir le développement d’un système de livraison d’acide nucléique de deuxième génération à base de chitosane.
1.1 Cadre de la recherche
Le contexte de cette thèse sera exposé dans le Chapitre 2 qui correspond à la revue de littérature inhérente à mon projet de Doctorat. Brièvement :
Les acides nucléiques (ANs), macromolécules biologiques portant l’information génétique, sont hydrophiles et portent une charge globale négative ce qui limite leur passage au travers des membranes biologiques. D’autre part, les ANs sont extrêmement sensibles et sont ainsi rapidement dégradés par les endonucléases contenues dans le plasma sanguin (Mintzer & Simanek, 2009). Le principal challenge de ces études est le design de transporteurs spécifiques qui permettront une transfection efficace. Ainsi pour placer le gène-médicament, on utilise des vecteurs capables de pénétrer les cellules et d’y libérer leur AN soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau (dépendamment du type de matériel génétique à introduire).
On dénombre deux catégories distinctes de vecteurs : les vecteurs viraux et les vecteurs non-viraux. Les vecteurs viraux sont des virus dont on a inhibé le potentiel infectieux, comme les rétrovirus ou les adénovirus. Ces derniers ont un taux de transfection élevé mais présentent une forte immunogénicité (Verma & Somia, 1997). Les vecteurs non viraux tels que les phospholipides et autres polycations sont à l’inverse faiblement immunogènes, moins onéreux mais ont des taux de
transfection moins élevés (Al-Dosari & Gao, 2009). Le rôle de tout type de vecteurs doit donc être de transporter les ANs dans la circulation sanguine, de passer efficacement les membranes biologiques (dont la membrane cellulaire) et de libérer leur matériel génétique à l’intérieur de la cellule.
Au sein de notre laboratoire (Biomaterials and Cartilage Laboratory, Polytechnique Montréal), le chitosane (CS) est utilisé en tant que vecteur non-viral pour la livraison d’ANs. Ce polycation d’origine naturelle va se lier à l’AN via interactions électrostatiques formant ainsi des polyplexes ou nanoparticules (NPs) dotées de charges résiduelles positives, notées polyplexes CS-AN. Lors de leur administration par voie parentérale (in vivo), les NPs sont confrontées à des conditions salines importantes et au pH physiologique, conditions qui masquent leurs charges répulsives et provoquent leur agglomération irréversible, facilitant ainsi leur reconnaissance et leur élimination par le complexe réticulo-endothélial (Mayer et al., 1989). D’autre part les protéines plasmatiques présentes dans le plasma sanguin (telles les opsonines), vont rapidement se lier à de telles particules permettant également aux macrophages de les reconnaitre puis de les éliminer rapidement sans qu’elles puissent jouer leur rôle thérapeutique (Owens & Peppas, 2006).
Un moyen de remédier à ces limitations et donc de prolonger la demi-vie des polyplexes in vivo, consiste à l’addition de poly(éthylène glycol) (PEG) au sein des formulations de NPs; procédé appelé PEGylation. En effet, ce polymère hautement hydrophile va créer un bouclier hydratant qui empêchera l’agrégation des particules et permettra par la même occasion de limiter les attaques des opsonines et autres enzymes de dégradation (Lee, J. H. et al., 1995).
On différenciera deux grandes stratégies de PEGylation pour les polyplexes CS-AN : le greffage de PEG en surface de la NP préformée et la formation de polyplexes à l’aide de copolymères CS- PEG (Casettari et al., 2012). Au niveau de cette dernière option, on distingue 2 types de copolymères CS-PEG : le copolymère à greffons, noté CS-g-PEG, où le PEG est greffé sur la chaine latérale du CS et le copolymère à blocs, noté CS-b-PEG, où le PEG est régiosélectivement attaché en bout de chaîne du CS.
La position latérale du PEG sur le CS présente deux inconvénients majeurs : D’une part le PEG serait susceptible de masquer les charges positives portées par les amines du CS et donc d’empêcher sa complexation aux charges négatives de l’AN ; et d’autre part le PEG pouvant se greffer à différentes positions sur la chaine de CS, un problème d’uniformité pourrait porter
préjudice à une bonne répétabilité des résultats. Ainsi, une fois conjugué en position terminale du CS, le PEG serait moins enclin à entraver la formation des polyplexes (Casettari et al., 2012). L’originalité de cette approche consiste à l’auto-assemblage de NPs via des copolymères à blocs CS-b-PEG et d’ANs. De tels polyplexes, appelés « Bloc ionomer complex », adoptent une structure micellaire dans laquelle l’acide nucléique serait complexé au chitosane par liaison électrostatique, le tout étant enrobé d’une pellicule de PEG protectrice (Kabanov, V. A. & Kabanov, 1998).
1.2 Objectifs
L’objectif principal de ce projet de Doctorat est donc la synthèse de copolymères à blocs, CS-b- PEG, en conjuguant le PEG sur l’extrémité terminale de la chaine de CS. De telles structures seront alors engagées avec de l’acide nucléique (ADN plasmidique) afin de former des complexes interpolyelectrolytes ayant un comportement micellaire, les BICs.
1.3 Approche envisagée
Afin de parvenir à la synthèse chimique de copolymères CS-b-PEG, il est tout d’abord nécessaire de déterminer avec précision le point d’attache du PEG sur l’extrémité terminale du CS. Une fois ce point d’encrage caractérisé, il sera important de sélectionner et d’appliquer une chimie de conjugaison adéquate pour s’assurer de l’efficacité et de la régiosélectivité du procédé de PEGylation. Le copolymère alors obtenu, il sera utilisé pour former des polyplexes PEGylés avec de l’ADN plasmidique par auto-assemblage.