Introduction

Durant l’oxydation d’amines biogènes (comme les catécholamines circulantes ou la sérotonine libérée par les plaquettes), les EROs générés par les MAOs des cellules vasculaires pourraient favoriser l’oxydation des LDLs et accélérer l’athérogénèse (Obata and Yamanaka 2001). D’ailleurs, l’inhibiteur de MAO-B, le L-déprényl, bloque l’oxydation des LDLs et leurs effets athérogènes (Thomas et al. 2002). Les résultats préliminaires à ce travail, ont montré que des doses faibles de sérotonine et la tyramine, sont mitogènes pour les CMLs.

L’objectif de ce travail a été d’étudier l’implication des EROs produits par la dégradation MAO-dépendante de la sérotonine et la tyramine, dans la prolifération des CMLs, et les voies de signalisation impliquées. Nous avons plus précisément étudié l’implication d’une voie mitogène de stress, récemment mise en évidence dans l’équipe, la voie MMP2/sphingomyelinase/sphingosine 1-phosphate. Les différents acteurs de cette voie sont brievement décrits dans la partie qui suit.

a. Les métalloprotéases

♦ Généralités sur les metalloprotéases

Les matrix metalloprotéinases (MMPs), sont une famille de métallo-endopeptidases zinc- dépendantes responsables, entre autres, de la dégradation des composants de la matrice. Les MMPs appartiennent plus précisément à la famille M10 et à la sous-famille A (matrixines). Elles peuvent être classées en deux groupes : les metalloprotéinases liées à la membrane (MT- MMPs : membrane-type MMPs) et les MMPs solubles ou zymogènes (MMPs), sécrétées sous forme inactive puis activées dans le milieu extracellulaire.

La principale fonction des MMPs reste la dégradation de la matrice extra cellulaire, qui contribue au remodelage tissulaire (résorption). Cependant, la matrice extra cellulaire fait non seulement partie de l’architecture extra cellulaire, mais peut également être considérée comme un réservoir de molécules biologiquement actives, y compris des facteurs de croissance (Sternlicht and Werb 2001; Visse and Nagase 2003). Sa protéolyse modifie la fonction de certaines macromolécules : ainsi, le clivage de la chaîne alpha2 de la laminine 5 par MMP2

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induit une migration de cellules épithéliales du sein en exposant un site cryptique promigratoire de la laminine 5 (Giannelli et al. 1997).

L’activité des MMPs est régulée par des inhibiteurs spécifiques : les TIMPs, qui participent au contrôle spécifique de l’activité locale des MMPs dans les tissus (Gomez et al. 1997; Nagase and Woessner 1999; Visse and Nagase 2003) ou des inhibiteurs pharmacologiques (Batimastat) (Galis and Khatri 2002; Visse and Nagase 2003).

Elles participent à de nombreux processus physiologiques (développement embryonnaire, organogénèse, ovulation, involution utérine postpartum, cicatrisation, angiogénèse, remodelage osseux) et pathologiques (arthrite, cancer, maladies cardiovasculaires,…) (Nagase and Woessner 1999). Les MMPs participent à l’angiogénèse, au remodelage vasculaire et à l’athérosclérose (Galis and Khatri 2002; Lijnen 2002; Visse and Nagase 2003). Les LDLs oxydées et les cytokines inflamatoires (IL-1, TNFα), modifient l'expression et l'activité des MMPs et des TIMPs (Galis and Khatri 2002).

Parmi toutes les metalloprotéases nous nous sommes plus particulièrement intéréssé à MMP-2 et MT1-MMP.

♦ MMP2

MMP-2, également connue comme gélatinase de 72kDa/collagénase type IV et gélatinase A, contient un domaine fibronectine-like au niveau du domaine catalytique, favorisant la liaison du substrat. Elle peut cliver un grand nombre de substrats incluant les gélatines, le collagène de type I, IV, V, VII, X, XI et XIV, la fibronectine, l’élastine, et les protéoglycanes.

MMP-2 est synthétisée sous forme d’une proenzyme de 72KDa (zymogène), sécrétée dans le milieu extracellulaire et activée, à la surface cellulaire, par clivage protéolytique (forme mature : 66KDa). Pro-MMP2 est activée in vivo par des Membrane-Type MMPs actifs (Okada et al. 1990; Butler et al. 1997; Llano et al. 1999; Murphy et al. 1999; Velasco et al. 2000), à l’exception de MT4-MMP (English et al. 2000). L’activité enzymatique de MMP2, est régulée par les TIMPs. En se liant à la proforme de MMP-2 ils en empêchent l’activation.

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54 ♦ MT1-MMP

MT1-MMP est une MT-MMP possédant un domaine transmembranaire et un domaine cytosolique C terminal (protéine de type I). Cette protéine a été identifiée en 1994 (Sato et al. 1994), et depuis de nombreuses études ont permis de bien la définir (Itoh and Seiki 2006). Elle est synthétisée sous forme de zymogène inactif et est activée par une proprotéine convertase (la furine) lors de son passage dans l’appareil de Golgi. MT1-MMP est située dans la membrane plasmique. Elle participe à la migration cellulaire, et se trouve pour cela généralement localisée dans la zone de migration des cellules migrantes (lamellipodes) (Sato et al. 1997; Itoh et al. 2001; Mori et al. 2002). Cette localisation spécifique est dirigée par CD44 qui interagit avec le domaine hémopexine de MT1-MMP (Mori et al. 2002).

MT1-MMP peut dégrader une grande variété de protéines de la matrice extra cellulaire, dont les collagènes de type I, II, et III, la fibronectine, la vitronectine, la laminine, la fibrine, et les protéoglycanes, et peut moduler les fonctions cellulaires en maturant un grand nombre d’autres protéines (Berthet et al. 2000; Belkin et al. 2001; Deryugina et al. 2002; Tam et al. 2004). Parmi les fonctions de MT1-MMP (communes avec d’autres MT- MMPs), se trouve également l’activation de pro-MMP-2 (Seiki et al. 2003).

Le clivage de pro-MMP-2 par MT1-MMP, largement étudié a montré la nécessité d’une coopération avec TIMP-2 (Butler et al. 1998; Toth et al. 2000). En effet proMMP-2 et TIMP-2 forment un complexe via leurs domaines C-terminal. L’extrémité N-terminal de TIMP-2 se lie à MT1-MMP (qui devient récepteur de pro-MMP-2, mais est inhibé par TIMP- 2), ce qui rapproche pro-MMP-2 de la surface de la cellule où un autre MT1-MMP adjacent et n’étant pas inhibé par TIMP-2 pourra cliver pro-MMP-2.

b. MMP-2, MT1-MMP et athérosclérose

L’action proangiogénique de MMP-2 a été décrite par Nguyen (Nguyen et al. 2001). MMP-2 intervient dans l’hypertrophie cardiaque (Ahmed et al. 2006), la crise cardiaque (Peterson et al. 2000) et dans toutes les étapes de la formation de la plaque d’athérome, sur des cibles variées. L’importance de MMP2 dans la formation de plaques d’athérome a été mise en évidence in vivo par le croisement de souris ApoE -/- (un modèle d’athérosclérose chez la souris délété pour l’apolipoprotéine E et développant spontanément des lésions athéroscléreuses) avec des souris MMP2-/- (knockout pour MMP2) : ces animaux

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développent beaucoup moins de lésions que les souris ApoE-/- utilisées comme contrôles (Kuzuya et al. 2006).

L’activation de MMP-2 sur des cellules endothéliales, des cellules musculaires lisses et des macrophages suite à stimulation par différents agents, a fait l’objet de nombreuses études in vitro et in vivo (Werle et al. 2002; Kuzuya et al. 2003; Johnson and Galis 2004).

MT1-MMP est un facteur important du remodelage matriciel, et a son importance dans de nombreuses maladies où la protéolyse ou l’invasion et la prolifération cellulaire sont dérégulées, non seulement parce qu’il participe de manière très active à ce remodelage matriciel pathologique, mais aussi indirectement en activant d’autres membres de la famille des matrix métalloprotéinases. Au niveau vasculaire, MT1-MMP participe à l’angiogénèse en favorisant l’invasion par les cellules endothéliales entre autres, et en stimulant la synthèse de VEGF (Chun et al. 2004; Sounni et al. 2004). Son expression est supérieure au niveau des lésions d’athérosclérose (Rajavashisth et al. 1999). Son activité peut être augmentée par la plupart des agents intervenant dans l’athérosclérose : LDL oxydées, interleukine1-alpha, TNF-alpha sur cellules musculaires lisses et monocytes (Rajavashisth et al. 1999; Hong et al. 2000; May et al. 2005; Tellier et al. 2007). Le stress oxydant up régule également MT1-MMP dans les cellules musculaires lisses et favorise l’invasion de celles-ci dans le vaisseau, participant au remodelage vasculaire de la matrice extra cellulaire ayant lieu lors de l’évolution de plaques d’athérome (Filippov et al. 2005; Valentin et al. 2005).

c. La voie des sphingolipides

Les sphingolipides sont des constituants des membranes lipidiques des cellules. Outre leur rôle structural au sein des membranes, ils ont également un rôle de second messager intracellulaire, intervenant dans la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’inflammation (Auge et al. 1999; Auge et al. 2000; Auge et al. 2002; Pettus et al. 2002; Watterson et al. 2005). Les sphingolipides sont généralement localisés dans des domaines bien précis de la membrane : les “rafts lipidiques”, où ils colocalisent avec des enzymes spécialisées dans le métabolisme des sphingolipides : la sphingomyélinase (Kilkus et al. 2003), la céramidase (Mitsutake et al. 2001), la sphingosine kinase (Urtz et al. 2004).

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56 ♦ La sphingomyélinase

La sphingomyélinase assure la conversion métabolique de la sphingomyéline en céramide. Plusieurs sphingomyélinases ont été à ce jour caractérisées différant essentiellement par leur pH optimal d’action, et leur localisation subcellulaire : la sphingomyélinase acide lysosomale (aSMase) (Gatt et al. 1966), Trois sphingomyélinases neutres (Marchesini and Hannun 2004) la sphingomyélinase alcaline (bile et tractus digestif). Nous nous sommes particulièrement intéressés à la sphingomyélinase neutre magnésium-dépendante (sphingomyélinase neutre de type 2 ou smpd3), décrite par l’équipe comme étape initiatrice de la voie mitogène des sphingolipides (Auge et al. 1998).

♦ La céramidase

La céramidase transforme le céramide en sphingosine. Il existe cinq formes de céramidases, la céramidase acide clonée en 1996 (Koch et al. 1996), deux céramidases neutres, dont l’une pouvant être mitochondriale (El Bawab et al. 2000), et deux alcalines (Mao et al. 2001).

♦ La sphingosine kinase

Elle phosphoryle la sphingosine sur sa fonction alcool. Il en existe deux à ce jour : SPK1 et SPK2 clonées récemment (Kohama et al. 1998; Liu et al. 2000). Ces deux isoenzymes semblent jouer au sein de la cellule deux rôles différents, voire opposés (Maceyka et al. 2005).

L’isoforme 1 (SphK1) est activée par des stimuli tels que facteurs de croissance et de survie et la sphingosine 1-phosphate qu’elle produit a un effet anti-apoptotique et mitotique (Olivera et al. 1999b; Edsall et al. 2001; Shu et al. 2002) mais ces effets ne semblent pas forcément médiés par un des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate (Olivera et al. 2003). L’isoforme 2 (SphK2) est moins connue. Elle favoriserait plutot une signalisation antimitotique et proapoptotique, indépendamment d’un récepteur (Igarashi et al. 2003; Liu et al. 2003). Nous nous sommes intéressés à SphK1 (Auge et al. 2004; Tellier et al. 2007).

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d. Rôle des sphingolipides dans l’atherosclérose

Les sphingolipides agissent comme seconds messagers intracellulaires dans les principaux phénomènes de la vie de la cellule impliqués dans l’athérosclérose : apoptose, migration, adhésion, prolifération, et ce dans tous les types cellulaires présents dans la plaque.

♦ L’apoptose

Le céramide est connu pour être proapoptotique lorsque sa concentration atteint un certain seuil et cet effet proapoptotique a été largement documenté y compris dans l’athérosclérose (cellules musculaires lisses, endothéliales, macrophages) (Chatterjee 1999; Auge et al. 2000; Steinbrecher et al. 2004). Selon le type cellulaire, la sphingomyélinase acide (cellules musculaires lisses, macrophages) (Loidl et al. 2003; Steinbrecher et al. 2004) et la sphingomyélinase neutre (cellules musculaires lisses) (Chatterjee 1999; Loidl et al. 2004) ont été décrites comme impliquées dans l’apoptose induite par le céramide dans le cadre de l’athérosclérose. Il semble que ce soit la balance entre le céramide et la sphingosine 1- phosphate qui détermine la survie ou l’apoptose des cellules (Cuvillier et al. 1996).

♦ La migration

La sphingosine 1-phosphate, a étét décrite comme inductrice de la migration des cellules endothéliales via ses récepteurs à sept segments transmembranaires Edg-1 et Edg-3 (endothélial differentiation gene) (Kimura et al. 2003) ou inhibitrice de la migration des cellules endothéliales, lymphocytes, cellules musculaires lisses … (Tamama and Okajima 2002).

♦ L’adhésion

L’UDP:galactose:glucocéramideβ1,4galactosyl-transférase produit du lactosylcéramide à partir du céramide. Des résultats obtenus avec ce glycosphingolipide

suggèrent qu’il intervient dans l’expression de molécules d’adhésion telles que ICAM-1 sur cellules endothéliales (Bhunia et al. 1998), et Mac-1 (Arai et al. 1998) sur les neutrophiles et macrophages, contribuant ainsi à leur adhésion à la surface des cellules endothéliales et initiant le processus d’athérosclérose (Chatterjee 1998).

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58 ♦ La prolifération

De nombreux sphingolipides sont mitogènes sur cellules vasculaires (céramide, sphingosine, sphingosine 1-phosphate, sphingosylphosphocholine, lactosylcéramide) (Chatterjee 1998; Auge et al. 2000)