Comme présentée au chapitre II.C.2. de l’introduction, l'invagination des cargos ubiquitinés au niveau des MVBs requière l'action de trois complexes : ESCRT I, II et III qui sont conservés de la levure à l'homme. Des levures mutées dans les complexes ESCRTs (mutants vps Classe E) présentent à la fois un ciblage à la membrane limitante de la vacuole/lysosome de cargos normalement destinés à la lumière de la vacuole et, de façon plus surprenante, une accumulation à la membrane plasmique de diverses protéines pouvant conduire, par exemple à la prolifération des cellules cancéreuses (voir chapitre III.E. de l’introduction). L’observation initiale à l’origine de mon projet de thèse est donc que dans la levure comme chez les mammifères des cellules déficientes pour la machinerie ESCRT accumulent une série de transporteurs et de récepteurs à la membrane plasmique. Cette observation pose la question de savoir comment et pourquoi un défaut au niveau d’une machinerie endosomale tardive se répercute très en amont de la voie d’endocytose au niveau de la membrane plasmique. Plusieurs auteurs ont proposé que ce dernier phénotype pourrait être dû à un recyclage accru des cargos internalisés, mais la démonstration formelle n’a pas pu être apportée dans grand nombre de cas faute de protocole adéquat.
Contrairement à l’exocytose et l’endocytose, les voies et les acteurs du recyclage restent largement méconnus chez la levure. Notre travail se basait donc sur ce double objectif : comprendre l’origine des phénotypes d’accumulation de protéines à la membrane plasmique dans les mutants ESCRT et tenter de mieux caractériser le recyclage chez S.cerevisiae. Nous avons abordé cette question en utilisant comme protéine modèle l’uracile perméase Fur4p dont les mécanismes moléculaires de l’endocytose ont été finement disséqués au laboratoire. Comme dans le cas d’autres transporteurs et récepteurs, nous avons montré que Fur4p est accumulée à la membrane plasmique de souches de levures déficientes pour la machinerie ESCRT en testant leur sensibilité au 5-FU (5-Fluoro Uracile), analogue toxique de l’uracile. L’accumulation de Fur4p à la membrane plasmique des mutants ESCRTs peut résulter soit d’un retard de l’endocytose soit d’un recyclage accru. Pour trancher entre ces deux hypothèses nous avons mis au point un protocole permettant de découpler l’endocytose du recyclage de Fur4p. Nous avons ainsi pu montrer que Fur4p était endocytée à une vitesse normale dans des souches déficientes pour les complexes ESCRTs. En revanche, dans ces mêmes cellules, la perméase est très efficacement recyclée à la membrane plasmique après son endocytose alors qu’elle est dégradée dans les vacuoles des cellules sauvages. Si l’ubiquitination de Fur4p est essentielle pour son internalisation, nous avons pu montrer que la dé-ubiquitination de Fur4p n’est pas requise pour son retour à la membrane plasmique.
Quelle est la route empruntée par Fur4p lors de son recyclage dans des souches déficientes pour les complexes ESCRTs ? Le recyclage de protéines internalisées est très peu documenté dans la levure. Seule une voie de recyclage a été bien décrite : celle empruntée par la v-SNARE Snc1p impliquée dans la fusion des vésicules sécrétoires à la membrane plasmique. Snc1p cycle entre Golgi, membrane plasmique et endosome précoce (Lewis et al. 2000). La machinerie nécessaire au recyclage de Snc1p est bien caractérisée (Pelham 2002). Nos expériences ont montré que le recyclage de Fur4p à la membrane plasmique n’est pas affecté dans des mutants déficients pour la machinerie de recyclage de Snc1p. De même, des mutations dans le complexe rétromère nécessaire au trafic entre les compartiments endosomaux tardifs et l’appareil de Golgi n’affectent en rien le retour de Fur4p à la membrane plasmique. L’ensemble de ces données suggèrent que Fur4p ne passe pas par les compartiments Golgiens lors de son recyclage vers la membrane plasmique. En résumé, nous avons mis en évidence une nouvelle voie de recyclage différente de celle empruntée par la v-SNARE Snc1p. En outre, nous avons pu démontrer que le complexe d’attachement HOPS/ Vps de classe C impliqué dans le ciblage à la vacuole et à l’endosome tardif (voir chapitre II.C.3. de l’introduction) intervenait de façon globale sur les recyclages de cargos (Fur4p / Snc1p) et des membranes, probablement parce qu’il est requis pour le bon fonctionnement de l’endosome précoce. En effet, dans les souches déficientes pour ce complexe, les cargos et membranes semblent piégés au niveau de l’endosome précoce qu’ils soient destinés à l’endosome tardif ou à l’appareil de Golgi. L’ensemble de ces résultats fait l’objet de la publication numéro 1.
Afin d’identifier la machinerie du recyclage de Fur4p, nous avons employé une approche génétique globale. Nous avons utilisé le fait que le recyclage accru de Fur4p dans des mutants ESCRTs provoque une hypersensibilité de ces souches au 5-FU comme outil pour ce crible. Des levures doublement déficientes pour ESCRT et pour un élément nécessaire au recyclage de Fur4p devraient retrouver un niveau de résistance normal au 5-FU. Nous avons donc cherché des mutations supprimant l’hypersensibilité au 5-FU d’un mutant déficient pour ESCRT après construction des 4800 double mutants déficients pour ESCRT et pour l’un des gènes de levure non-essentiels à la viabilité. Après vérification directe du recyclage de Fur4p dans les souches devenues résistantes au 5-FU, uniquement deux candidats ont pu être confirmés, Ump1p et Ydr290w. Ump1p intervenant dans l’assemblage du protéasome, il nous semble probable que l’effet de cette protéine sur le recyclage de Fur4 soit plutôt indirect via la dégradation d’une protéine intervenant dans le trafic de Fur4p par exemple. Ydr290w n’a pas de fonction connue et des problèmes expérimentaux nous ont empêché d’aller plus loin. En parallèle de ce crible dont les résultats se sont avérés décevants, nous avons également mené une approche gènes candidats. Nous nous sommes intéressés aux protéines de fonction peu caractérisée au sein de cinq familles impliquées dans les voies de trafic : les petites GTPase de type RAB, les nexines, les complexes d’attachement, les adaptateurs Ggas et les protéines à domaine EH ainsi qu’aux machineries du recyclage de Chs3p et Gap1p dont l’identification est contemporaine à notre étude. Aucun défaut important de recyclage de Fur4p n’a été observé dans l’ensemble des délétants pour les
98 gènes codant pour ces protéines suggérant que la machinerie de recyclage de Fur4p diffère de celle des autres cargos et/ou qu’il y a une redondance potentielle parmi les membres de ces machineries.
Enfin, nous avons également étudié le recyclage de Fur4p quand son trafic endosomal est bloqué au niveau de l’endosome précoce dans un mutant pep12∆. Afin de déterminer la route suivie par Fur4p lors de ce recyclage, nous avons tenté de construire des souches délétées pour PEP12 et pour des gènes codant des acteurs nécessaires au recyclage de l’endosome précoce à l’appareil de Golgi. Mais, la combinaison de ces deux types de délétion s’est avérée létale pour les cellules. En utilisant un mutant de la GTPase/Ypt, Vps21p (Ypt51p), supposé bloquer également le trafic de Fur4p au niveau de l’endosome précoce, nous avons cependant pu répondre à cette question. En effet, la délétion de facteurs impliqués dans le trafic endosome précoce, Golgi bloque le recyclage de Fur4p dans un contexte vps21∆. Cette observation est intéressante car elle montre qu’un même cargo (Fur4p) peut suivre deux routes de recyclage différentes : une ne passant pas par l’appareil de Golgi depuis un compartiment de nature endosomale tardive et un recyclage par l’appareil de Golgi, comme Snc1p, depuis l’endosome précoce. Dans les deux cas, l’étape finale de fusion à la membrane plasmique semble dépendante de l’exocyste.