2.3.1 Principe de comparaison et analyse des gènes
L’échec de la recherche suivant le modèle d’identité nucléaire m’a conduit à appliquer le modèle de ségrégation aléatoire à l’analyse des données (modèle 2).
Les gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes sont exprimés dans les deux noyaux mat+ et mat-. Afin de les identifier, il faut comparer un croisement où le complexe FPR1/FMR1/SMR2 est absent avec un croisement où il est présent. Le croisement où le complexe FPR1/FMR1/SMR2 est absent implique une souche fpr1- ou fmr1
partenaire sauvage de type sexuel opposé. Le croisement formant le complexe
FPR1/FMR1/SMR2 implique une souche sauvage mat- et un partenaire sauvage mat+.
Selon le modèle 2, les gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes sont les gènes différentiellement exprimés entre le croisement sauvage 2WT mat+ X 2WT mat- et le croisement 2 fpr1- X 2 WT mat- (Liste 2). Ces gènes doivent être également différentiellement exprimés entre le croisement sauvage 2 WT mat- X 2 WT mat+ et le croisement 2 fmr1
-smr2- X 2 WT mat+ (Liste 3). Dans la liste 1 et la liste 4 les gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes ne doivent pas être différentiellement exprimés. En effet, dans la liste 1 on compare deux croisements qui ne forment pas le complexe FPR1/FMR1/SMR2 et aucun gène nécessaire à la formation des hyphes ascogènes n’est exprimé. Dans la liste 4 on compare deux croisements formant le complexe
FPR1/FMR1/SMR2 et tous les gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes sont exprimés (Figure 25).
Figure 25 : Plan de comparaison des croisements utilisés dans l’étude de la reconnaissance internucléaire selon le modèle 2.
154 gènes sont communs entre la liste 2 et la liste 3, dont 113 gènes accumulent plus de transcrits dans les croisements sauvages que dans les croisements 2 fpr1-X 2 WT mat- et 2 fmr1
-smr2-X 2 WT mat+ et 41 gènes accumulent plus de transcrits dans les croisements 2 fpr1-mat+ X 2 WT mat- et 2fmr1
-smr2-mat- X 2WT mat+ que dans les croisements sauvages.
2.3.2 Fonctions des gènes
Comme dans le cas de l’analyse fonctionnelle des gènes impliqués dans la RI selon le modèle 1, la majorité des gènes de la liste des gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes ont des fonctions inconnues. Le reste des gènes interviennent dans différents processus biologiques (Annexe 8). Le processus de transduction de signal (Pa_1_18840), le transport et le trafic cellulaire (Pa_6_1130), le métabolisme énergétique (Pa_5_11750)1et la
9ABCD343
9ABCD353
9ABCD323
1 fpr1-
X 2 WT mat-
Gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes réprimés
1 WT mat+ X 2WT mat-
Gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes activés
1 fmr1-
smr2- X 2WT mat+
Gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes réprimés
1 WT mat- X 2 WT mat+
Gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes activés
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transcription (Pa_1_16130).1Certains de ces gènes ont des orthologues chez S. cerevisiae et N. crassa qui sont impliqués dans le développement sexué: YDR403W l’orthologue de Pa_7_190 code une enzyme qui intervient dans la maturation de l’enveloppe des spores. YDR371W l’orthologue de Pa_5_3290 code une chitinase impliquée dans la sporulation et l’orthologue de Pa_1_22370 chez N. crassa (NCU07325) code une protéine spécifique à la conidiation.
2.3.3 Analyse phénotypique et délétion des gènes cibles
12 gènes de la liste des gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes sont sélectionnés pour la délétion et l’analyse phénotypique (Tableau 9, Annexe 8). Ces gènes ont un FC 82 dans la comparaison 2 WT mat+ X 2 WT mat-
/
2 fpr1-X 2 WT mat- (Liste 2) et la comparaison 2 WT mat- X 2 WT mat+/2 fmr1-smr2- X 2 WT mat+ (Liste 3). Ils possèdent des orthologues dans les champignons ayant une étape de reconnaissance internucléaire dans leur cycle. Les gènes ayant un rôle majeur dans le métabolisme n’ont pas été sélectionnés pour les délétions.
Gene number Fonction
FC Liste 2
FC Liste 3
Pa_1_290 Unknown function 7,53 16,49 Pa_1_540 Unknown function 7,36 9,57 Pa_1_21670 Unknown function 6,42 12,69 Pa_6_11710 Unknown function 5,98 9,17 Pa_1_18840 Unknown function 5,68 10,37
Pa_5_940 Unknown function 5,59 6,98 Pa_4_2080 Unknown function 5,44 9,81 Pa_1_3290 Unknown function 5,14 6,14 Pa_5_90 Unknown function 5,02 5,78 Pa_1_18880 Unknown function 4,91 7,73 Pa_1_17250 Unknown function 4,85 4,69 Pa_6_1130 Putative Annexin 4,58 5,82
Tableau 9: Les génes sélectionnés pour la délétion dans la liste des gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes.
Selon le modèle 2, on attend que la délétion d’un gène nécessaire à la formation des hyphes ascogènes affecte la RI quand elle est localisée dans les deux parents mat+ et mat-. L’analyse de la fertilité mâle et femelle, du développement de périthèces et de la production
d’ascospores dans des croisements homozygotes pour chaque délétion n’a révélé aucun phénotype particulier par comparaison à un croisement sauvage.
3. Conclusion
Les étapes contrôlées par les protéines régulatrices FPR1, FMR1 et SMR2 au cours de la reproduction sexuée sont maintenant bien déterminées mais les mécanismes mis en jeu sont inconnus. Le problème que nous voulons résoudre est le mécanisme de la RI. Les approches génétiques, destinées à rechercher des gènes cibles des facteurs de transcription MAT impliqués dans la RI ont toutes échouées. Devant ces échecs, nous avons choisi de rechercher ces gènes cibles par une autre méthode que les méthodes génétiques en utilisant une approche microarray.
Dans cette étude, nous avons analysé le transcriptome des périthèces issus de deux croisements, l’un entre un mutant fpr1- et un partenaire sauvage mat- et l’autre entre un mutant fmr1
-smr2- et un partenaire sauvage mat+. Le profil transcriptomique de chaque croisement mutant est comparé d’une part à celui de l’autre croisement mutant et d’autre part à un croisement témoin sauvage.
Nos résultats montrent une grande complexité du système d’analyse. Les résultats ont été interprétés selon deux modèles. Dans le premier modèle, dit d’identité nucléaire, chaque noyau possède une identité spécifique constituée par des molécules spécifiques des noyaux mat+ ou spécifiques des noyaux mat-. Selon ce modèle, 8 gènes spécifiques mat+ et 18 gènes spécifiques mat- ont été identifiés, mais aucun de ces gènes n’a une fonction déjà décrite dans le développement sexué. Le deuxième modèle est basé sur la coopération entre un noyau mat+ et un noyau mat- pour former un complexe des facteurs de transcription FPR1, FMR1 et SMR2. Ce régulateur contrôlerait les gènes nécessaires à la formation des hyphes ascogènes contenant les deux noyaux mat+ et mat-. Selon ce modèle, 154 gènes communs entre mat+ et mat- ont été identifiés dont certains ont des fonctions potentielles dans plusieurs processus biologiques. Nous avons tenté de valider expérimentalement successivement chacun de ces deux modèles. Aucune des 46 souches mutantes construites ne présente un défaut du développement sexué. En conclusion aucun des deux modèles n’a pu être validé et le mécanisme de la RI reste encore à découvrir.
Il existe plusieurs explications possible à cet echec : soit plusieurs mutations sont nécessaires pour affecter la RI, soit nous n’avons pas sélectionné la bonne liste des gènes nécessaire à la RI, soit la régulation de la RI par les facteurs de transcription MAT implique un troisième modèle plus complexe que les deux modèles proposés. Si une approche transcriptomique devait être refaite, il conviendrait d’utiliser un matériel biologique plus
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spécifique du stade que nous étudions. En effet, nous avons utilisé un mélange constitué de fragment de mycelium et de périthèces entiers, incluant à la fois l’enveloppe d’origine maternelle et le centrum constitué des tissus sexués où a lieu la RI. Des techniques de microdissection laser sont actuellement developpées par le laboratoire de Minou Nowrousian pour isoler des cellules spécifiques des champignons et appliquer les nouvelles méthodes de RNAseq http://homepage.ruhr-uni-bochum.de/Minou.Nowrousian/projects.html. Cette technique permettrait d’isoler le centrum et de focaliser l’analyse transcriptomique sans être géné par l’effet maternel. Je propose également de déterminer le site de fixation de FPR1, FMR1 et SMR2 par des approches moléculaires, ce qui nous aidera à sélectionner facilement leurs cibles dans les listes des gènes obtenus. Enfin il faut étudier la relation de FPR1, FMR1 et SMR2 avec d’autres facteurs de transcription susceptibles de contrôler la RI.