Internalisation de la CRT exogène par les macrophages

La différence significative observée entre le signal de fixation de la CRTr-A488 par les macrophages à 4 °C et à 37 °C pose la question du mécanisme par lequel cette protéine est internalisée par les phagocytes. L’analyse des cellules THP1 qui ont internalisé de la CRTr fluorescente en microscopie confocale révèle, d’une manière intéressante, la présence de larges vésicules vertes intracellulaires indiquées par des flèches blanches sur la figure 37. Le diamètre moyen de ces vésicules d’environ 3.2 µm ainsi que leur forme plus ou moins circulaire pourraient évoquer un mécanisme d’endocytose par macropinocytose (Fujii et al., 2013). En effet, la macropinocytose appelée aussi « cell drinking » est définie comme l’absorption non spécifique des molécules solubles, nutriments et antigènes. C’est un processus dépendant de l’actine qui commence par la formation des « ruffles » membranaires donnant ensuite lieu à de larges vésicules endocytiques appelées « macropinosomes » distinctes des autres types de vésicules endocytiques par leur large diamètre mesurant entre 0.2 à 5 µm et leur structure (pour revue Liu et Roche, 2015).

Figure 37. Etude de l’internalisation de la CRT exogène par les macrophages THP1.

Après leur incubation avec 10 µg/ml de CRTr-A488 à 37 °C pendant 1 h, les cellules THP1 induites sont lavées, fixées au PFA 4% pour être finalement visualisées en microscopie confocale.

DIC

DAPI Merge

Pour confirmer qu’il s’agit bien d’une internalisation par macropinocytose, nous avons eu recours à 2 inhibiteurs utilisés spécifiquement pour étudier ce processus : l’amiloride EIPA (Ethylisopropylamiloride) et la cytochalasine D (Fujii et al., 2013 ; Koivusalo et al., 2010). Ces 2 inhibiteurs agissent directement ou indirectement pour bloquer la polymérisation d’actine indispensable au cours de la macropinocytose.

Ainsi, les cellules THP1 induites au PMA sont pré-traitées avec de la cytochalasine D ou de l’EIPA, avant d’être incubées en présence de la CRTr-A488. L’analyse en cytométrie de la fluorescence des cellules représentée dans la figure 38 montre que la cytochalasine D (figure 38.c) et l’EIPA (figure 38.d) sont capables, tous les deux, d’inhiber significativement l’absorption de la protéine fluorescente par les cellules. Cela se traduit par une diminution de plus de 50% de la moyenne de fluorescence dans les 2 conditions par rapport à celle obtenue avec les cellules non traitées (figure 38.b). Ces résultats confirment l’observation faite en microscopie et démontrent que l’internalisation de la CRT exogène dans les macrophages s’effectue bien selon un mécanisme de macropinocytose.

Figure 38. Analyse de l’internalisation de la CRT exogène par les macrophages traités par la cytochalasine D et l’EIPA.

Les phagocytes différenciés THP1 sont incubés avec 20 µM de cytochalasine D (CytD) ou 100 µM d’EIPA pendant 30 minutes. Les cellules sont ensuite mises en contact avec 10 µg/ml de CRTr-A488 pendant 1 h à 37 °C. Les résultats de l’absorption de la CRT fluorescente représentés sous forme d’histogrammes sont obtenus en cytométrie. La moyenne d’intensité de fluorescence (MFI) est indiquée pour chaque condition. Le contrôle correspond aux cellules qui n’ont pas été incubées avec de la CRTr-A488.

CRTr-A488 No mb re d e ce llu le s CRT-fluorophore MFI = 27 – b. MFI = 12 EIPA d. Superposition e. MFI = 10 CytD c. MFI = 7 Contrôle a.

Dans le but de déterminer une éventuelle contribution des récepteurs endocytiques dans l’internalisation de la CRT exogène, nous avons étudié le rôle du co-récepteur CD91 associé à la CRT au niveau de la membrane des phagocytes.

Pour cela, j’ai commencé par vérifier l’expression de CD91 à la surface de notre modèle de macrophages THP1. Comme l’illustre l’histogramme A de la figure 39, la majorité de ces cellules exprime significativement CD91 à leur membrane.

J’ai effectué ensuite des expériences pour inhiber la fixation de la CRT exogène en utilisant soit un anticorps spécifique anti-CD91 soit la protéine recombinante RAP (Related-Associated Protein), une chaperonne capable de lier étroitement CD91 et d’inhiber sa liaison avec ses ligands (Bu, 1998). Différentes conditions de blocage ont été testées (changement de concentration, température), sans pouvoir pour autant détecter une variation nette de la fixation de CRT ni avec l’anticorps anti-CD91, ni avec la protéine RAP (résultats non montrés). Des analyses de co-localisation CD91/CRTr-A488 en microscopie confocale ont été également effectuées et les sites de co-localisation observés entre les 2 molécules semblaient très rares (figure 39.B).

Ces résultats suggèrent que la fixation/internalisation de la CRT exogène par les phagocytes dans nos conditions ne dépendrait probablement pas du récepteur CD91. Cette fixation pourrait alors impliquer d’autres récepteurs potentiels comme par exemple SREC-1, un récepteur endocytique connu de la calréticuline (Berwin et al., 2004).

Figure 39. Expression de CD91 sur les macrophages THP1 et comparaison de sa localisation avec celle de la CRT exogène.

A. Vérification par cytométrie de l’expression de CD91 (courbe rouge) à la surface des macrophages THP1. Le contrôle est effectué en absence de l’anticorps primaire anti-CD91 (courbe grise). B. Comparaison par microscopie confocale de la localisation de CD91 et de la CRT exogène dans les macrophages THP1. Pour cela, ces cellules sont immunomarquées par un anticorps primaire anti-CD91 et un secondaire couplé à la cyanine 3. La CRTr-A488 (10 µg/ml) est ajoutée lors de l’incubation avec l’anticorps secondaire. Toutes les étapes sont effectuées sur la glace et les cellules sont fixées par la solution de PFA 4% à la fin du marquage.

B. A. DIC DAPI CRT CD91 Merge Nombr e de cellul es CD91-secondaire

III.3.4 Conclusion

Les résultats présentés dans cette partie montrent que les cellules phagocytaires sont capables de lier et d’internaliser la CRT d’origine externe, d’une manière probablement indépendante du récepteur CD91.

L’accumulation de la calréticuline dans de larges vésicules endocytaires à l’intérieur des macrophages ainsi que l’inhibition de son internalisation en présence de deux molécules spécifiques (la cytochalasine D et l’EIPA), suggèrent fortement qu’il s’agit d’un mécanisme de macropinocytose.