Interactions avec des ligands spécifiques

La découverte d’interactions entre la PrPsc et différents ligands a entraîné le développement de tests basés sur une extraction / purification sélective avant une détection par des techniques plus classiques. Il s’agit notamment du plasminogène, d’aptamers d’acides

nucléiques, de l’apolipoprotéine B ou encore de polymères anioniques (Fischer et al, 2000;

Lane et al, 2003; Safar et al, 2006; Sayer et al, 2004).

Une autre piste proposée concerne l’amélioration de la précipitation de la PrPsc à partir d’un homogénat tissulaire par l’utilisation de streptomycine (Moussa et al, 2006). Cette molécule, grâce à ses groupements ammonium et guanidine, interagit via des liaisons électrostatiques avec différents acides aminés d’une même ou de plusieurs molécule de PrP.

Après traitement PK, il se forme des agrégats multimériques de complexes [PrPres – Streptomycine] qu’il est possible de séparer sélectivement des autres composants du milieu par une simple centrifugation. La formation de ces complexes n’altère en rien la réactivité des sites antigéniques vis-à-vis des anticorps monoclonaux anti-prion, permettant la détection par un Western Blot. Dans une étude réalisée à partir de PrPsc extraite de cerveau de hamster surchargée dans différents liquides biologiques, cette technique a permis un gain de sensibilité important par rapport aux contrôles sans streptomycine (Dong et al, 2007). La précipitation par la streptomycine n’est cependant pas sélective de la forme pathologique, même si elle semble avoir plus d’affinité pour la PrPsc que pour la PrPc. L’étape de traitement PK est donc nécessaire pour discriminer les isoformes de PrP en Western Blot. Dans une étude sur des homogénats de cerveau et de rate de souris, cette technique semblerait toutefois détecter la PrPres à des dilutions jusqu’à mille fois plus faibles que par une méthode d’ultracentrifugation classique (Leclere et al, 2008). Le profil obtenu n’est cependant pas caractéristique de la PrPres pour ces dilutions.

3.5.2 Alternatives au traitement par la protéinase K

La difficulté principale du traitement par la PK est la juste détermination de la quantité nécessaire à la destruction de l’ensemble de la forme cellulaire tout en conservant la plus grande fraction possible de la forme pathologique. En effet, le concept de résistance de la PrPsc est une propriété qui s’avère être finalement relative, une partie de la PrPsc étant sensible à l’action de la PK (Gambetti et al, 2008; Pastrana et al, 2006; Safar et al, 1998).

L’étude de la sédimentation sur gradient de sucrose en présence de détergents a montré que la PrPsc de la tremblante du mouton se répartit en différentes fractions dont les moins denses contiennent des agrégats de petite taille (moins de 20 molécules de PrP, soit une masse d’environ 600 kDa). Ces oligomères, contrairement aux polymères de grosse taille beaucoup plus denses, sont sensibles à l’action de la PK (Pastrana et al, 2006; Tzaban et al, 2002). Ces

données suggèrent qu’il existe des agrégats de PrPsc de taille hétérogène et que la structure quaternaire influence la sensibilité à l’action de la PK. Sous certaines conditions et probablement de façon variable selon la souche de PrPsc, le traitement PK peut alors diminuer fortement la sensibilité de la détection, voire même entraîner des résultats faussement négatifs. Pour s’affranchir de cet écueil, différentes équipes soit proposent d’utiliser d’autres modes de dégradation de la PrPc, soit développent des outils ou des techniques spécifiques de la PrPsc.

Une première option concerne un traitement par de la guanidine suivi d’une extraction par un mélange phénol / chloroforme, sans traitement PK (Bastian et al, 2005). L’étape d’immunorévélation fait intervenir un anticorps non spécifique de la forme pathologique.

Pour différencier les patients atteints de MCJ des témoins, les auteurs mettent en avant la différence des profils de migration obtenus entre les cas positifs et les cas négatifs par technique Western Blot. Ils relèvent en effet la présence de plusieurs bandes de faible poids moléculaire apparent (inférieur à 27 kDa) ainsi qu’une bande majoritaire à 27 kDa. Dans les cas négatifs, la bande majoritaire se situe à 38 kDa et les bandes inférieures à 27 kDa sont absentes.

Une équipe a récemment remplacé l’étape PK par une étape de traitement par la thermolysine (Owen et al, 2007). La thermolysine est une protéase thermostable dont le site de clivage se situe dans des zones riches en acides aminés hydrophobes, tels que la leucine, l’isoleucine, la phénylalanine, la valine, l’alanine ou la méthionine. Pour la PrP, les premiers acides aminés impliqués du côté N-terminal sont la méthionine en position 112 et la valine en 115. Dans sa conformation pathologique, et contrairement à la forme cellulaire, ces acides aminés ne sont pas accessibles rendant alors l’action de la thermolysine impossible. La PrPsc après traitement par la thermolysine conserve donc la totalité de sa structure, contrairement au traitement PK qui entraîne l’élimination d’une séquence N-terminale. Sur une souche de PrPsc murine (RML), le traitement par 100 µg/ml de thermolysine 1h00 à 70°C permet la dégradation complète de la PrPc et conserve la fraction de PrPsc sensible à la PK (Cronier et al, 2008).

Dans des conditions dénaturantes, une équipe a montré qu’il existe une différence de réactivité entre les deux formes de PrP vis-à-vis d’un anticorps monoclonal (Safar et al, 1998). Cette propriété est à la base d’un test immunométrique dépendant de la conformation

ou CDI. Dans une étude comparant les différents tests disponibles avec des échantillons identiques, la sensibilité du CDI s’avère être équivalente à celle du Western Blot pour des homogénats de cerveau. En revanche, pour des échantillons dilués dans du plasma, une version optimisée du test s’avère être cette fois 50 à 100 fois plus élevée (Minor et al, 2004).

Une autre possibilité pour s’affranchir de l’étape de traitement par la PK consiste en la reconnaissance spécifique de la conformation de la forme pathologique par l’anticorps utilisé dans le test diagnostic. Parmi la diversité des anticorps monoclonaux disponibles, peu d’entre eux sont dits « conformationnels ». Il s’agit notamment du 15B3 (Korth et al, 1997), d’un anticorps dirigé contre un motif très accessible de la PrPsc (Tyr-Tyr-Arg) (Paramithiotis et al, 2003), du V5B2 spécifique d’un fragment C-terminal de la PrPsc (Curin Serbec et al, 2004) et du P1:1 dirigé contre une séquence d’acides aminés centrale 106-126 (Jones et al, 2008). Ces anticorps présentent toutefois une affinité qui s’avère moins bonne à l’usage qu’espéré lors de leur production. Par ailleurs, certains anticorps non spécifiques de la PrPsc semblent finalement être capables de la précipiter assez sélectivement (Morel et al, 2004).