Nous aborderons ici les interactions existant entre les sous-unités E et des protéines autres que les sous-unités des CCVD. Cet aperçu non exhaustif nous permettra de réaliser l’étendue des fonctions accomplies par les sous-unités E
2.1. Interaction avec les protéines RGK
Parmi la super-famille des protéines Ras, les protéines RGK constituent une sous-famille de petites protéines qui lient le GTP (Guanosine Triphosphate). Cette sous-famille comprend quatre membres, Rem (également nommée Rem1 ou Ges), Rem2, Rad et Gem (l’homologue murin est connu sous le nom de Kir). Les RGK exercent leur fonction via leur changement de conformation d’une forme active liée à GTP à une conformation inactive liée à GDP (Correll, Pang et al. 2008). Beguin et al. ont montré en 2001 que ces RGK fonctionnent comme inhibiteurs potentiels des CCVD via leur interaction directe avec la sous-unité Edes CCVD (Beguin, Nagashima et al. 2001). Plus exactement ces auteurs ont découvert l’interaction in vitro de Kir/Gem lié à GTP avec les sous-unités E1, E2 et E3. Par ailleurs, ils ont étudié le rôle fonctionnel de Kir/Gem sur les CCVD, en co-exprimant la sous-unité canalaire Cav1.2 ou Cav1.3 avec E1, E2 ou E3 et Kir/Gem dans des ovocytes de xénope. Ces expérience ont révélé l’inhibition les CCVD de type-P/Q et –N par Kir/Gem via son interaction avec les sous-unités E. Cette réduction de l’activité des CCVD s’explique par une diminution de l’expression de la sous-unité canalaire à la membrane plasmique. En 2005, ce même groupe de recherche a démontré l’interaction d’un autre membre des RGK, Rem2, avec les sous-unités E, de manière dépendante à GTP. Rem2 inhibe l’activité des CCVD en bloquant l’expression de la sous-unité canalaire à la membrane plasmique (Béguin, Mahalakshmi et al. 2005). Le mécanisme par lequel les protéines RGK régulent l’activité des CCVD a été examiné. La localisation nucléaire des RGK (plus exactement Rad, Rem et Kir/Gem) est modulée par 14-3-3 et la Ca2+-calmoduline (Béguin, Mahalakshmi et al. 2005; Béguin, Mahalakshmi et al. 2006). Les protéines RGK sont capables de séquestrer la sous-unité E au noyau de manière dépendante à 14-3-3 et la Ca2+-calmoduline empêchant ainsi l’interaction de la sous-unité E3 avec la sous-unité canalaire et bloquant de ce fait l’ancrage des CCVD à la membrane (Béguin, Mahalakshmi et al. 2006).
34 Interaction avec HP1J
Concernant l’interaction d’un variant tronqué de E4, E4c avec HP1J, se référer au paragraphe 3.5 du Chapitre 1.
2.3. Interaction avec les protéines synaptiques
Il est bien établit que la sous-unité canalaire des CCVD activés à haut voltage interagit avec les protéines synaptiques telles que la syntaxine, SNAP-25 ou encore la synaptotagmine. Ces interactions jouent un rôle important dans l’amarrage des vésicules de fusion à la membrane plasmique et leur fusion (Sheng, Westenbroek et al. 1998). De récents travaux ont montré l’interaction de la sous-unité E avec des protéines synaptiques. Plus exactement, en 2007, l’équipe de Mori, a détecté par la technique du double hybride et par des expériences de co-immunoprécipitation, l’interaction de la sous-unité E4b avec RIM1, un composant essentiel de la zone présynaptique active (Kiyonaka, Wakamori et al. 2007). Cette interaction engage la partie C-terminale de RIM1 et le module SH3-HOOK-GK. L’interaction de RIM1 et E4b est impliquée dans la libération de neurotransmetteurs par deux mécanismes : le maintien de l’influx Ca2+ par inhibition de l’inactivation des CCVD et l’ancrage des vésicules contenant les neurotransmetteurs à proximité des CCVD. Il a été également montré que la partie N-terminale de E4a et E3 est engagée dans des interactions dépendantes du calcium avec la synaptotagmine I ; des concentrations élevées de Ca2+ (10 mM) empêchant cette interaction (Vendel, Terry et al. 2006). L’importance au niveau fonctionnel de cette interaction reste encore inconnue.
Il est important de noter que ces interactions s’ajoutent à celles existant entre la sous-unité canalaire des CCVD et les protéines synaptiques telles que la syntaxine, SNAP-25 et la synaptotagmine I et jouent un rôle important dans l’amarrage et la fusion des vésicules synaptiques (Sheng, Westenbroek et al. 1998).
35 2.4. Interaction avec la dynamine
La dynamine fait partie d’une large famille de GTPases impliquées dans des processus tels que l’endocytose, le transport de vésicules, la division d’organites ou la cytokinèse. La dynamine comporte au minimum trois modules, un domaine GTPase en N-terminal, un domaine conservé au centre de la protéine et un domaine GTPase en C-terminal (Praefcke et McMahon 2004). Cependant la majorité des dynamines incluant les dynamines de mammifère I, II et III, présente des domaines supplémentaires : un domaine homologue de la pleckstrine responsable de la liaison de phospholipides et un domaine riche en prolines qui interagit avec le domaine SH3 de nombreuses protéines. Un domaine SH3 est présent dans la sous-unité E des CCVD, cependant la structure cristallographique prédisait l’incompatible liaison de ce domaine avec des ligands polyproline (Chen, Li et al. 2004; Van Petegem, Clark et al. 2004). Pourtant en 2007, le laboratoire d’Hidalgo a observé in vitro l’interaction du domaine SH3 de la sous-unité E2a des CCVD ;ɴ-SH3) avec la dynamine (Gonzalez-Gutierrez, Miranda-Laferte et al. 2007). Cette association entraîne la réduction du nombre de CCVD à la membrane dans l’ovocyte de xénope par internalisation des CCVD, effet qui peut-être inversé par la préincubation d’un peptide GST-Dyn829-842 connu pour bloquer l’interaction entre la dynamine et les domaines SH3. Ceci traduit l’importance de l’interaction de la sous-unité E2a avec la dynamine dans les processus d’endocytose des CCVD. Très récemment, le même laboratoire a mis en évidence l’importance de l’homodimérisation de ɴ -SH3 par un simple pont disulfure dans le processus d’endocytose des CCVD de type-L (Miranda-Laferte, Gonzalez-Gutierrez et al. 2011). En effet la substitution d’une seule cystéine dans le mutant ɴ-SH3 C113A abolit la capacité de dimérisation et empêche l’internalisation des CCVD bien que l’interaction de ɴ-SH3 C113A avec la dynamine soit préservée. Cette même étude indique dans les cellules TSA 210 que la sous-unité E2a des CCVD localisée à la membrane forme des oligomères. La formation de ces oligomères est réduite par Cav1.2. L’association de E2a avec un motif AID empêche en effet la dimérisation de E2a et l’internalisation des CCVD. Ceci conforte l’idée que les rôles de E2a dans la régulation des paramètres sensibles au voltage des CCVD et leur internalisation sont deux fonctions exclusives de E2a.
2.5. Interaction avec la bestrophine
La bestrophine-1 (Best1) correspond à un canal ionique Cl- exprimé dans l’épithélium pigmentaire de la rétine dont les mutations sont à l’origine de la dégénérescence maculaire chez l’Homme et le chien (Hartzell, Qu et al. 2008). Dans un sytème de co-expression des CCVD de type-L et de fragments de la partie C-terminal de Best1, les motifs riches en proline entre les acides aminés 330 et
36 346 de Best1 ont été reconnus pour leur capacité d’interaction avec les sous-unités des CCVD via leur domaine SH3 (Yu, Xiao et al. 2008; Reichhart, Milenkovic et al. 2010). L’interaction physique de la protéine entière, Best1 avec les sous-unités ɴ des CCVD a été confirmée cette année par l’équipe de ^ƚƌĂƵɴĞƚĂů͘(Milenkovic, Krejcova et al. 2011). Best1 module les propriétés biophysiques des CCVD de type-L dans l’épithélium pigmentaire de la rétine. Cependant en absence des sous-unités des CCVD E2a ou E4 ou en présence de la sous-unité ɴ3 des CCVD, l’activité des CCVD de type-L n’est plus modulée par Best1 (Yu, Xiao et al. 2008; Reichhart, Milenkovic et al. 2010). Ces différents travaux laissent penser que Best1 régule les CCVD de type-L via leur interaction avec les sous-unités E et plus précisément avec E2a ou E4.
2.6. Interaction avec les canaux potassiques à large conductance activés par le voltage et les
ions Ca2+
Les canaux potassiques à large conductance activés par le voltage et les ions Ca2+ (BKCa) sont activés comme leur nom l’indique coopérativement par la dépolarisation membranaire et la liaison d’ions Ca2+ cytoplasmiques. Ils contribuent en présence d’autres canaux ioniques, à la régulation de l’amplitude et la fréquence des décharges de potentiels d’action, l’initiation et la propagation d’ondes dendritiques Ca2+, la libération d’hormones et de neurotransmetteurs et la modulation de la contraction musculaire (Salkoff, Butler et al. 2006). La sous-unité canalaire des BKca est codée par le gène Slo1 aussi nommé KCNMA1. En 2008, l’équipe de Dryer a montré l’interaction de la sous-unité ɴ1 des CCVD avec la partie cytoplasmique C-terminale de Slo1 (Zou, Jha et al. 2008). Cette interaction module les propriétés biophysiques de ces canaux, plus précisément ɴ1 ralentit les cinétiques d’activation de Slo1.
2.7. Interaction avec le transporteur du Zinc 1
Comme pour toutes les cellules, les neurones doivent maintenir une certaine concentration intracellulaire en zinc, en effet des concentrations en zinc trop faibles inhibent la croissance et la division cellulaire alors que de trop fortes concentrations peuvent être toxiques pour les neurones (Colvin, Davis et al. 2000). Dans ce cadre, le transporteur de zinc 1 (ZnT-1) intervient dans le métabolisme et confère aux cellules une résistance à la toxicité du zinc. ZnT-1 a également été caractérisé comme inhibiteur des CCVD de type-L (Beharier, Etzion et al. 2007). En 2009, Lévy et al. ont remarqué que cette modulation de la fonction des CCVD de type-L se faisait par l’intermédiaire de la sous-unité E des CCVD (Levy, Beharier et al. 2009). La sous-unité E2a interagit avec ZnT-1 dans les cellules HEK293. Cette interaction est responsable de la diminution d’expression à la surface de la sous-unité canalaire Cav1.2.