Inhibition de la formation de biofilm

Le potentiel anti-biofilm de toute la série de 14-mères tri-subsitués, incluant les peptides amidés, a été vérifié à des concentrations de 64 à 256 µg/mL sur un modèle Gram négatif (S. mutans ATCC 25175, aérobie) et Gram négatif (F. nucleatum ATCC 25586, anaérobie). Les peptides testés n’ont eu aucun effet sur le biofilm de F. nucleatum.

Des résultats plus encourageants ont été obtenus avec S. mutans. Certains peptides ont inhibé la croissance de la bactérie à des concentrations de 256µg/L dans les conditions expérimentales de la formation de biofilm. Parmi eux, les peptides amidés NPO 159A et NPO 159C ont montré des CMIs de 32 µg/L dans ces conditions, comparativement à 64 µg/L pour NPO 159D et NPO 159E.Toutefois, un composé est considéré « anti-biofilm » lorsque l’inhibition de la formation du biofilm est observée à des concentrations qui n’inhibent pas la croissance planctonique des bactéries. Globalement, l’inhibition de la formation du biofilm de S. mutans par les 14-mères semble liée à l’activité antimicrobienne de ces peptides, qui dans les travaux actuels s’est surtout avérée significative contre les streptocoques.

Temps (min)

Luminescence relative (%)

NPO159D Rac27-A1 ROMM-25A

4,8 µg/mL 9,6 µg/mL 4,8 µg/mL 9,6 µg/mL 4,8 µg/mL (9,6 µg/mL) 0 102 ± 7 101 ± 5 96 ± 2 98 ± 4 95 ± 5 94 ± 5 15 72 ± 7 41 ± 7 49 ± 11 39 ± 3 - - 30 45 ± 10 33 ± 6 41 ± 12 25 ± 7 98 ± 3 86 ± 4 45 23 ± 2 22 ± 5 21 ± 6 15 ± 4 54 ± 5 42 ± 4 60 13 ± 3 12 ± 5 24 ± 6 16 ± 7 49 ± 5 33 ± 3

Temps (min) 4,8 µg/mL NPO159A 9,6 µg/mL 4,8 µg/mL NPO159C 9,6 µg/mL 4,8 µg/mL ROMM-24A 9,6 µg/mL 4,8 µg/mL ROMM-25B 9,6 µg/mL

0 85 ± 13 51 ± 14 97 ± 3 76 ± 11 98 ± 2 100 ± 3 87 ± 2 53 ± 8 15 22 ± 6 31 ± 11 19 ± 2 16 ± 2 102 ± 6 102 ± 6 29 ± 1 14 ± 2 45 15 ± 5 15 ± 7 11 ± 2 10 ± 2 67 ± 5 52 ± 6 16 ± 1 16 ± 1

4.6 Discussion

Les 14-mères n’ont pas montré l’activité antimicrobienne espérée vu les résultats antérieurs où leur activité avait été rapportée contre une souche différente d’E. coli. Plusieurs facteurs expérimentaux influencent les résultats des tests de susceptibilité antibiotique et peuvent expliquer la baisse d’activité dans la présente étude, en commençant par les souches testées.

D’abord, le temps d’incubation peut avoir un impact sur les valeurs obtenues avec la méthode de dilution en série. Des études effectuée sur plusieurs combinaisons de bactéries et d’antibiotiques estiment que la CMI double dans environ 30% des cas lorsque le temps d’incubation passe de 24 à 48 heures avec un inoculum initial de l’ordre de 105 _{CFU/mL. Cet effet varie en fonction de la concentration microbienne inoculée et dépend}

principalement du mode d’action du médicament.230,231

Toutefois, un temps d’incubation prolongé est fortement susceptible de faire augmenter l’IC50 mesurée. Avec le

temps, la croissance des microorganismes des contrôles positifs (sans antimicrobiens) passe en phase stationnaire, alors que la croissance exponentielle se poursuit dans les puits où la croissance est ralentie par l’antibiotique à l'étude. Le pourcentage relatif de la densité optique par rapport au contrôle augmente alors progressivement. Une durée d’incubation de 24 h a été choisie puisque seule l’IC50 a pu être rapportée pour

plusieurs peptides.

C’est la taille de l’inoculum initial qui a la plus grande influence sur les concentrations inhibitrices (CMI, IC50)

obtenues avec cette méthode. On peut estimer que la CMI double chaque fois que la population microbienne initiale est augmentée d’un facteur 10, et ce, indépendamment du temps d’incubation.230 _{Ainsi, des paramètres}

expérimentaux appropriés sont nécessaires pour obtenir des valeurs qui soient comparables à celles des références. Malgré les nombreuses lignes directrices et la variété de tests standardisés qui ont été développés, la détermination reproductible de l’activité antimicrobienne demeure un défi.231

Dans les travaux antérieurs réalisés par Pierre-Alexandre Paquet-Côté et Nicolas Poulin, l’activité antimicrobienne était évaluée avec un inoculum initial de 2 à 7 x 103 _{UFC/mL. Ainsi, il est normal d’avoir obtenu}

des CMIs supérieures avec les tests standardisés qui sont initiés avec 100 fois plus de bactéries. La différence importante qui a été remarquée rappelle la pertinence de considérer la densité de population lorsqu’on évalue l’activité des PACs. Assumant une relation linéaire entre la densité optique et la population bactérienne, le Tableau 9 compare les ratios de peptides et de bactéries dans les méthodes utilisées lors des travaux qui ont présentés dans le présent mémoire.

Tableau 9. Comparaison des ratios de 14-mères et de bactéries dans les différentes méthodes expérimentales

Valeur / Test Antimicrobien Perméabilité Viabilité Biofilm

DO660 inoculée au départ 0,00025¥ 0,4 0,01 0,1

Concentration bactérienne (UFC/mL) 5 x 105 _{8 x 10}8 _{2 x 10}7 _{2 x 10}8 Facteur d’excès bactérien par rapport au

test antimicrobien 1 1 600 40 400

Concentration de peptide maximale (µg/mL) 256 256 9,6 256

Concentration de peptide équivalente

(µg/mL) dans le test antimicrobien 256 0,16 0,24 0,64

Rapport bactérie/peptide (UFC/µg) 2 x 103 _{3 x 10}6 _{2 x 10}6 _{8 x 10}5 ¥ _{DO660 ajustée à (0,07), puis diluée 1/140 et ½ dans la plaque. 0,07/280 = 0,00025.}

Force est de constater que les tests de perméabilité membranaire et de viabilité sont effectués sur une population bactérienne beaucoup plus dense que pour l’évaluation standardisée de l’activité antimicrobienne. Cependant, les rapports de proportion entre les concentrations de peptides et de bactéries sont du même ordre de grandeur pour ces deux méthodes et peuvent être comparés. Dans les deux cas, les peptides les plus actifs sont les mêmes (NPO 159A, NPO 159C, NPO 159D et ROMM25B) et agissent dans les 15 premières minutes d’incubation. Les autres peptides testés ont des effets moins significatifs et la cinétique d’activité est cohérente entre les deux méthodes. Il semble en effet y avoir une corrélation entre le temps où le signal de fluorescence atteint le maximum et l’abaissement de la viabilité. Bien que cela soit logique et puisse signifier que la perturbation de la membrane déstabilise et affaiblit les bactéries, un antibiotique bactéricide n’ayant aucun effet sur la structure de la membrane mènerait à des résultats similaires. En effet, puisque le colorant SYTOX® Green pénètre les cellules mortes, le test de perméabilisation membranaire peut aussi être utilisé comme indicateur de mortalité.

Dans l’éventualité d’un effet bactéricide des 14-mères, les deux expériences seraient des indicateurs différents du même effet. Certains indices contredisent cette hypothèse, à commencer par le fait que la viabilité se stabilise dans tous les cas entre 10 et 20% de luminescence relative après avoir chuté. Ce qui implique qu'une certaine proportion de bactéries demeure viable. De plus, la même quantité de peptide est exposée à environ 1000 fois plus de bactéries dans les tests de viabilité et de perméabilité que dans le cas du test antimicrobien. Considérant qu’aucune CMI n’a été observée contre E. coli et que la valeur de la CMI est fortement influencée par la taille de population inoculée, il est invraisemblable que les résultats obtenus par spectroscopie de luminescence et de fluorescence ne soient le résultat de l’action bactéricide des 14-mères. Supportés par les travaux antérieurs concluants de perméabilité des vésicules et les propriétés connues de la littérature pour les PACs similaires, les résultats soutiennent l’hypothèse d’un mode d’action membranaire.

D’autre part, les tests anti-biofilm et antimicrobiens sont effectués dans des milieux de culture nutritifs qui favorisent la croissance microbienne et sont poursuivis pour 24 heures. En contrepartie, les tests de perméabilité et de viabilité observent l’impact des PACs sur les bactéries dans la première heure d’incubation dans une solution tampon pauvre en nutriments. À la lumière de tous ces résultats, on peut imaginer que les 14-mères perturbent la membrane bactérienne rapidement et suffisamment pour tuer les microorganismes si la concentration est suffisante et les conditions moindrement hostiles. Dans une suspension nutritive, certaines bactéries qui survivent à l’effet rapide des 14-mères pourraient enclencher à retardement un cycle de croissance exponentielle, de sorte que la population bactérienne résultante au bout de 24 heures ne soit pas affectée. L’inhibition apparente du biofilm semble être la conséquence de ce retard de croissance et non d’une activité anti-biofilm spécifique liée à la perturbation de voies de métaboliques. Ceci n’est pas particulièrement surprenant puisque les 14-mères comportent des acides aminés non-naturels encombrés, ce qui est inhabituel en comparaison aux peptides qui interfèrent dans les communications intercellulaires et les voies du QS bactérien.

Conclusion

L’objectif de ces travaux était d’évaluer l’activité antimicrobienne et anti-biofilm de trois familles de dérivés peptidiques synthétiques dans un contexte de microbiologie buccale. Le biofilm oral est un modèle exquis de communauté polymicrobienne où les interactions et les communications entre les microorganismes sont essentielles au développement du biofilm et de la pathogenèse. Des microorganismes phylogénétiquement éloignés sont susceptibles de développer des modes de communication communs ou analogues lorsqu’ils partagent un habitat. Pour cette raison, lors de la découverte d’un agent anti-biofilm, il est pertinent de vérifier le spectre d’activité avec des microorganismes de la même niche écologique.

L’activité anti-biofilm des dipeptides cycliques et des pipérazines étudiées dans ce mémoire a été rapportée pour la première fois. La rationnelle sous-jacente au design de séries de composés était consciencieuse de la relation entre la structure et l’activité des molécules. Puisque les peptides sont des molécules chirales et que les procédés biologiques sont stéréosélectifs, les stéréoisomères des dipeptides actifs ont été synthétisés pour vérifier l’influence de la configuration totale. Bien qu’aucune des molécules étudiées n’ait influencé le biofilm des bactéries pathogènes parodontales, des découvertes intéressantes ont été faites en étudiant la bactérie cariogène S. mutans et le mycète Candida albicans. Le QS des pathogènes parodontaux demeure le moins bien caractérisé parmi ces microorganismes, malgré les efforts de la littérature. En contrepartie, des molécules de nature peptidique régulent fréquemment les voies métaboliques et la signalisation chez les bactéries Gram- positives, ce qui faisait de S. mutans une cible plus probable pour les peptides candidats.

La synthèse d'une librairie d’analogues de 2,5-dicétopipérazines a été effectuée et leur étude a permis l’identification d’un motif actif inattendu. Les dipeptides cycliques naturels sont des métabolites connus d’une multitude d’organisme dont les propriétés anti-biofilm et la capacité d’interférer dans les communications inter- espèces sont documentées. Les présents travaux décrivent la découverte d’agents anti-biofilm inédits, puisque le motif éther de benzyle utilisé pour protéger les chaînes latérales des tyrosines ne se retrouve pas dans les dipeptides cycliques naturels. Ces composés anti-biofilm synthétiques montrent une activité améliorée et une synthèse simplifiée par rapport à leurs analogues déprotégés, dont certains ont déjà été isolés de populations bactériennes. Puisque les dipeptides ont aussi permis de prévenir l’adhérence des microorganismes à une surface biomimétique, il semble que l’inhibition de l’adhérence non-spécifique contribue à leur activité anti- biofilm. De telles propriétés suggèrent que les dipeptides agissent comme perturbateurs des communications microbiennes, s’inscrivant dans la stratégie antimicrobienne de quorum quenching. Les 2,5-dicétopipérazines présentées dans ce mémoire sont particulièrement intéressantes puisqu’elles sont facilement accessibles par une voie de synthèse simple, robuste et stéréosélective sur support solide.

Les recherches ont été poursuivies avec les produits de réduction des dipeptides, une famille de molécules pour laquelle peu de propriétés anti-biofilm ont été rapportées. L’évaluation de la relation entre la structure et l’activité a montré les mêmes tendances pour les deux premières familles de composés, bien que la portée de leur activité varie grandement. Les pipérazines ont montré un effet inhibiteur sélectif contre le biofilm fongique à des concentrations significatives en milieu biologique. La pipérazine semble empêcher un processus d’adhérence spécifique puisqu’elle empêche l’adhérence de C. albicans aux cellules épithéliales, mais non à la surface abiotique d’hydroxylapatite. Cet effet ainsi que l’inhibition de la morphogénèse à des concentrations bien en- deçà de l’activité fongicide indiquent que la pipérazine perturbe certaines voies métaboliques du fungus. Le principal intérêt de cette découverte réside en la participation des amines dans le mécanisme d’action, ce qui pourrait être expliqué par la formation d’une liaison hydrogène avec les enzymes, les récepteurs ou les régulateurs avec lesquels la pipérazine interfère. Les pipérazines rapportées dans la littérature pour leurs propriétés antimicrobiennes et anti-biofilm sont rares et encombrées. Le cycle pipérazine est dans la plupart des cas un motif de liaison N-substitué servant plutôt à faire le lien entre les autres groupements fonctionnels. L’activité anti-biofilm des pipérazines présentées dans ces travaux constitue donc une découverte innovante et intéressante.

Des expériences de biologie moléculaire permettraient de décrire les mécanismes d’actions et de déterminer les voies métaboliques affectées par les dipeptides cycliques et leurs pipérazines dérivées. Investiguer la différenciation de l’expression génique lorsque les microorganismes sont exposés aux composés serait une approche intéressante pour illustrer et définir la vraisemblance du mode d’action proposé. Notamment, des tests effectués avec des souches mutantes de C. albicans permettraient de préciser les voies de signalisations par lesquelles les pipérazines inhibent la transition morphologique. Une fois les pistes restreintes, on peut envisager d’utiliser la modélisation moléculaire pour prédire les sites de liaison ou d’interférence avec des régulateurs potentiels. D’autres études sont aussi nécessaires pour connaître le potentiel thérapeutique des 2,5- dicétopipérazines et des pipérazines bioactives. Par exemple, des tests de synergie avec différents antimicrobiens permettraient d’évaluer la possibilité d’utiliser ces composés comme adjuvants pour améliorer le traitement des infections à biofilm.

Dans le cas des peptides cationiques 14-mères, les travaux ont mis en évidence une activité plus importante contre les bactéries à Gram positif, particulièrement les streptocoques. Les résultats ont confirmé l’effet de ces peptides sur E. coli malgré l’impossibilité de déterminer une CMI. La suite logique du projet serait de vérifier si la perturbation membranaire a lieu sur davantage de microorganismes. De plus, la méthode utilisée peut être adaptée pour permettre de vérifier l’intégrité membranaire de cellules de mammifères. Il serait intéressant de poursuivre ces travaux pour déterminer si les 14-mères tris-arginine perméabilisent la membrane cellulaire humaine. Encore une fois, de plus amples investigations seraient utiles pour déterminer le pouvoir adjuvant des

14-mères, puisque les PACs sont connus pour augmenter la susceptibilité aux antimicrobiens. L’activité antimicrobienne relativement faible n’est pas alarmante puisque la plupart des perturbateurs membranaires cationiques présentent des CMIs élevées in vitro. De plus, le principal désavantage des PACs d’un point de vue thérapeutique est la rapidité avec laquelle ils sont hydrolysés dans l’organisme puisque ce sont des molécules peptidiques. Il est possible que la présence et la proximité de plusieurs acides aminés non naturels et encombrés confère aux 14-mères une certaine résistance à la digestion enzymatique, ce qui pourrait aussi être vérifié lors de travaux futurs. Cependant, la synthèse peptidique des 14-mères à l’échelle industrielle, bien que possible, serait un processus relativement long, considérant de surcroît la nécessité de préparer les phénylalanines greffées d’un éther couronne. Un survol de la littérature permet de constater que des PACs plus courts, plus simples et souvent plus actifs que les 14-mères ont été développés et caractérisés. Conséquemment, il est peu réaliste que les peptides 14-mères développés jusqu’à maintenant ne mènent à des applications thérapeutiques.

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