IV. Les Thymidylates Synthases : différents types et implications
3 Inhibition de la FDTS
Avec la littérature concernant le mécanisme de l’enzyme et les études cristallographiques du site actif, plusieurs stratégies d’inhibition ont été développées avec la synthèse de composés venant interférer dans 2 phases majeures du mécanisme enzymatique :
1 - Le transfert du méthylène sur la dUMP 2 - Le transfert d’hydrure sur le FAD
La particularité des potentiels inhibiteurs de la FDTS est qu’ils doivent nécessairement présenter une spécificité élevée pour cette dernière et une faible spécificité pour la thymidylate synthase humaine afin de minimiser la toxicité induite par ce type de composé.
37 a) Leduc, D.; Graziani, S.; Lipowski, G.; Marchand, C.; Maréchal, P. L.; Liebl, U.; Myllykallio, H. Functional Evidence
for Active Site Location of Tetrameric Thymidylate Synthase X at the Interphase of Three Monomers. PNAS 2004, 101, 7252–7257. b) Koehn, E. M.; Perissinotti, L. L.; Moghram, S.; Prabhakar, A.; Lesley, S. A.; Mathews, I. I.; Kohen, A. Folate Binding Site of Flavin-Dependent Thymidylate Synthase. PNAS 2012, 109, 15722–15727.
Ainsi, plusieurs équipes se sont intéressés à développer des inhibiteurs sélectifs de la FDTS et la première publication dans ce sens date de 2008 où l’équipe de Herscovici publie une librairie de composés partageant un motif 2-phenylthiazolidine (Figure 9).38
Figure 9 : Exemples d’inhibiteurs actifs sur la FDTS accompagnés de leur constante d’inhibition exprimée en µM.
Dans cette publication, 2 composés 32 et 33 se révèlent actif à des concentrations submicromolaires sur la FDTS et les auteurs prouvent que 2 types d’inhibition ont été observées pour ces 2 composés. Ainsi, 32 est un inhibiteur compétitif de la dUMP car l’augmentation de la concentration de la dUMP induit une forte réduction de l’inhibition enzymatique, ce qui n’est pas observé pour le second composé 33.
En 2011, Lescrinier et al. publie une grande bibliothèque d’analogues de la dUMP fonctionnalisés en C5
par de longues chaînes lipophiles.39 Cette fonctionnalisation induit l’impossibilité du transfert de
méthylène lors de la catalyse enzymatique car ces composés constituent aussi des inhibiteurs compétitifs de la dUMP. Le lead 30 a montré une activité sur la FDTS (IC50 : 0.91 µM) mais surtout une
sélectivité intéressante avec une IC50 sur la TSase humaine supérieure à 50 µM. A partir de ces résultats
préliminaires, une pharmacomodulation de ce lead a été effectuée et publiée dans la littérature.40 La
chaîne octynamide en C5 a été conservée mais les modifications structurelles explorées se sont portées
sur la partie osidique par la synthèse de dérivées acycliques connues comme étant des mimes de ribose. Le composé 31 a montré une activité satisfaisante (43% d’inhibition à 50 µM) mais réduite comparée au lead publié 2 ans auparavant.
38 Esra Önen, F.; Boum, Y.; Jacquement, C.; Spanedda, M. V.; Jaber, N.; Scherman, D.; Myllykallio, H.; Herscovici, J.
Design, Synthesis and Evaluation of Potent Thymidylate Synthase X Inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 2008, 18, 3628–3631.
39 Kögler, M.; Vanderhoydonck, B.; De Jonghe, S.; Rozenski, J.; Van Belle, K.; Herman, J.; Louat, T.; Parchina, A.; Sibley,
C.; Lescrinier, E.; et al. Synthesis and Evaluation of 5-Substituted 2′-Deoxyuridine Monophosphate Analogues As Inhibitors of Flavin-Dependent Thymidylate Synthase in Mycobacterium Tuberculosis. J Med Chem 2011, 54, 4847–4862.
40 Parchina, A.; Froeyen, M.; Margamuljana, L.; Rozenski, J.; De Jonghe, S.; Briers, Y.; Lavigne, R.; Herdewijn, P.;
Lescrinier, E. Discovery of an Acyclic Nucleoside Phosphonate That Inhibits Mycobacterium Tuberculosis ThyX Based on the Binding Mode of a 5-Alkynyl Substrate Analogue. ChemMedChem 2013, 8, 1373–1383.
Une approche différente a été entreprise par l’équipe de Myllykallio, avec la synthèse d’analogues de napthoquinones qui, par
π
-stacking, interagissent avec le FAD et par leur potentiel oxydo-réducteur, captent les hydrures responsables de la réduction de ce dernier.41 Parmi les quinones testées sur laFDTS, la meilleure inhibition de la réduction du FAD fut obtenue avec le composé 34 et possédant une IC50 de 4.5 µM. Suite à ces résultats préliminaires et dans le but de comprendre les interactions et le
mode d’action de ce dernier, les auteurs ont alors réalisé le docking de 34 dans le site actif de plusieurs FDTS cristallisées et ont observé que ce composé occupait le site actif par une intéraction forte avec le FAD et plus spécifiquement, occupait partiellement la poche de liaison de la dUMP. Comme précédemment, la pharmacomodulation de ce lead a été effectuée et publiée en 2015.42 La seule partie
modifiée sur ce lead est le groupement p-méthoxybenzyl qui a été remplacé par divers hétéroaromatiques et, de cette étude, la plupart des composés synthétisés montrent des activités inhibitrices de la FDTS supérieures. Le composé le plus actif de la série 35 porte un noyau furane avec une IC50 de 0.4 µM, l’inhibition est alors décuplée par rapport à 34.
Enfin, des études de criblage à haut débit ont été effectuées sur la FDTS avec l’usage de méthodes in silico, tel que le docking sur les structures crystallines de l’enzyme disponibles de chimiothèques diverses.
Par cette méthode, Blundell et al. ont pu identifié plus de 2000 potentiels inhibiteurs dont 13 qui reproduisent les interactions avec les cofacteurs du site actif par
π
-stacking avec la dUMP et le FAD mais aussi par liaison hydrogène avec des résidus de type arginine. Parmi ces composés, la plupart ne présentaient aucune ou une legère inhibition et seulement un composé disposant d’un squelette de type 1H-imidazo[4,5-d]pyridazine a montré une inhibition de 29% de Mtb-ThyX à 100 µM.43Récemment, Herdewijn et al. a publié une étude de criblage à haut débit en mesurant l’inhibition d’une chimiothèque de plus de 40000 composés par un dosage spectrophotométrique en retour basé sur l’oxydation du NADPH en NADP+ catalysé par Mtb-ThyX. Cette méthode expérimentale très efficace a
permis de mettre en évidence 7 composés possédant de faibles IC50 et une sélectivité envers la FDTS. Le
lead issu de cette publication possède un squelette de type 1,4-benzoxazine qui lui permet une forte affinité avec le site actif se traduisant expérimentalement par une faible IC50 de 710 ± 20 nM.44