Influence du polymère

3.3 Influence du polymère

L’influence du PEG et du PLGA sur la structure secondaire de la BSA en solution a été étudiée. ¾ Influence du PEG

Le PEG est un polymère hydrophile soluble autant dans l’eau que dans l’HFIP. Etant utilisé dans les deux solvants lors des tests d’électrofilage (Tableau 4-2), il a donc aussi été analysé en DC dans les deux solvants en présence de BSA. Les concentrations en PEG utilisées sont de 1, 5 et 10 %. Ces concentrations ont été choisies car elles sont assez proches des concentrations des solutions utilisées en électrofilage (Tableau 4-2). La concentration en BSA a été fixée à 0,05 mg/mL. Seul le rapport du signal obtenu à 208 et 222 nm a été utilisé pour comparer les spectres entre eux car le PEG a tendance à faire saturer le détecteur vers les faibles longueurs d’onde et notamment vers 191 nm (Figure 4-5-(e)) Le pic de saturation imposé par la présence de PEG se déplace vers les longueurs d’onde élevées avec une augmentation de sa concentration dans la solution. Pour une même concentration, l’absorption du PEG s’effectue à une longueur d’onde plus faible dans l’HFIP que dans l’eau, au point de ne pas apparaître pour 1% de PEG dans l’HFIP. Hormis la présence de pic de saturation, le PEG ne présente pas de signal de DC.

Les spectres de la BSA dans l’eau en présence de PEG à différentes concentrations sont présentés en Figure 4-5-(a). Les spectres présentent des tendances très similaires. Les rapports de signal sont aussi très similaires : la différence par rapport à la structure native de la BSA dans l’eau est entre 0,2% et 5% (Figure 4-5-(c)). L’écart-type sur les valeurs de rapport de signal a été calculé sur deux spectres différents. L’écart-type le plus élevé a été obtenu sur l’échantillon contenant 10% de PEG et correspond à 7% du rapport obtenu sur la BSA dans l’eau. Il semblerait donc que les variations obtenues sur les rapports de signal ne soient pas significatives. La présence de PEG en solution aqueuse jusqu’à 10% ne semble donc pas induire (ou très peu) de modifications de la structure secondaire de la BSA.

Les spectres de la BSA dans l’HFIP en présence de PEG à 1, 5 et 10% sont présentés en Figure 4-5-(b). Les spectres suivent aussi la même tendance que celle observée pour les solutions dans l’eau. Les rapports de pics à 208 et 222 nm sont très proches : la différence du rapport entre la BSA dans l’HFIP seul ou en présence de PEG varie de 0,1 pour 10% de PEG et de 6% pour 1% PEG (Figure 4-5-(d)). Cette fois, l’écart-type n’a pas pu être calculé sur tous les échantillons. Seul l’écart-type obtenu en partie 3.2 a été reporté. Il correspond à 10% du rapport de signal obtenu pour la BSA dans l’HFIP. Les différences de rapport obtenues étant inférieures à l’écart-type, les variations entre les rapports ne sont donc sûrement pas significatives. Les rapports de signal à 191 et 208 nm ont aussi pu être calculés pour la BSA dans l’HFIP et la BSA dans l’HFIP-PEG1%. Ils sont respectivement de 2,0 et 1,5 ce qui correspond à 25% de différence. Bien qu’élevée cette différence reste inférieure à l’écart-type obtenu pour la BSA dans l’HFIP qui est de 33%. Le PEG n’induirait donc pas plus de modification de structures secondaires de la BSA par rapport à l’HFIP seul.

Ces résultats confirment ce qui a été trouvé dans la littérature sur la structure secondaire de lysozyme en présence de 10% de PEG à 1000 Da dans l’eau [153]. Dans ce cas non plus, le spectre DC de la protéine n’avait pas été modifié en présence de PEG. Dans cette étude, il a aussi été remarqué que la protéine avait tendance à interagir préférentiellement avec le solvant plutôt que le PEG. Les charges électriques présentes sur la protéine ont effectivement tendance à rendre défavorable l’interaction PEG-protéine. L’absence d’interaction est d’ailleurs la raison pour laquelle le PEG a une action stabilisante sur la protéine [154]. Il n’est en revanche pas possible, dans cette étude, d’affirmer que le

119

PEG joue un rôle de protecteur de la protéine vis-à-vis du PLGA comme cela est avancé dans la littérature [150], [154].

Figure 4-5 Influence du PEG sur la structure de la BSA. (a)(c) Spectres de DC de la BSA dans l'eau et PEG à différentes concentrations et rapports de signal à 208 et 222 nm. (b)(d) Spectres de DC de la BSA dans l’HFIP et

PEG à différentes concentrations et rapport

¾ Influence du PLGA

Le PLGA a été dissous dans l’HFIP en présence de BSA selon des concentrations de 0,001%, 0,01% et 0,1%. Ces concentrations sont de 100 à 10 000 fois plus faibles que les concentrations utilisées en électrofilage (Tableau 4-2) car cette gamme a dû être adaptée en fonction des limites expérimentales. Effectivement, le PLGA présente un signal de DC important dont le maximum se trouve vers 210 nm. Il se trouve donc proche des pics caractéristiques du spectre de la BSA à 208 et 222 nm (Figure 4-6-(c)).

120

En présence de 0,1% de PLGA, le signal DC du polymère devient prédominant, ce qui rend le spectre obtenu très différent comparativement aux trois autres spectres. Au-delà de 0,1% de PLGA, le signal de DC est très rapidement saturé et aucun spectre de BSA ne peut être exploité.

Comme précédemment, la concentration en BSA a été fixée à 0,05 mg/mL dans chaque solution. Les spectres correspondants à ces différentes conditions sont présentés en Figure 4-6-(a). Les spectres de la BSA dans l’HFIP et en présence de PLGA à 0,001% ou 0,01%, ont une allure globale similaire. Les différences de rapports d’intensité des pics caractéristiques présentent les mêmes tendances (Figure 4-6-(b)). La différence de rapport à 191 et 208 nm est de 9% pour le PLGA à 0,001% et 5% pour le PLGA à 0,01%. La différence de rapport à 208 et 222 nm est de 2% pour le PLGA à 0,001% et 1% pour le PLGA à 0,01%. Une différence plus marquée est présente entre les spectres et les rapports obtenus entre la BSA dans l’HFIP et la BSA dans l’HFIP en présence de 0,1% de PLGA : 37% de différence pour le rapport à 191 et 208 nm et 12% de différence pour le rapport à 208 et 222 nm. Ces différences sont importantes mais elles restent tout de même inférieures ou proche de l’écart type obtenu sur les spectres de la BSA dans l’HFIP. Celui-ci correspond à 50% du rapport du signal à 191 et 208 nm et à 9% du rapport à 208 et 222 nm. Ainsi, il n’est pas possible d’affirmer que les différences observées sur les spectres soient significatives et que la présence de PLGA jusqu’à 0,1% induisent des modifications structurales significatives de la BSA.

Figure 4-6 Influence du PLGA sur la structure de la BSA. (a) Spectres de DC de la BSA dans l'HFIP et en présence de PLGA à 0.001%, 0.01% et 0.1%. (b) Rapport du signal de DC à 191 et 208 nm et à 208 et 222 nm pour les différentes conditions testées (les * indiquent les valeurs de rapport pour lesquels un écart-type n’a pas pu être

défini). (c) Spectres bruts de la BSA (spectre bleu) et de la solution référence (spectre orange) pour les différentes conditions testées.

121

Une concentration à 0,1% de PLGA dans l’HFIP correspond à une solution en régime dilué (C.K.Mw^a = 0,2 Chapitre 2, Figure 2-11, page 48) alors que la concentration de PLGA utilisée en électrofilage d’environ 10%, correspond à une solution en régime enchevêtré (C.K.Mw^a = 20 Chapitre 2, Figure 2-11, page 48). En régime dilué très peu d’interactions existent entre les chaînes de polymère et donc avec la BSA alors qu’en régime enchevêtré, des interactions existent sûrement entre les chaînes de polymère et la BSA. Ainsi, les concentrations testées ne sont sûrement pas représentatives des conditions que subit réellement la protéine lors des essais en électrofilage. Ces essais ont tout de même permis de définir les conditions expérimentales pour la suite de l’étude : afin d’exploiter les spectres de la BSA en présence de PLGA de manière fiable, la concentration de PLGA ne doit pas dépasser 0,1%. Ainsi, pour la suite de l’étude, la concentration du polymère en solution a été fixée à 0,1%.