Inflammation du tissu adipeux associée à l’obésité

Cette partie a pour objectif de résumer les principaux travaux concernant l’inflammation du TA associée à l’obésité. L’augmentation exponentielle de la littérature récente reflète l’engouement de la communauté scientifique pour ce sujet qui a donné une nouvelle dimension aux relations entre développement de la masse grasse et désordres métaboliques qui y sont associés. Depuis les premières observations cliniques et sur modèles animaux, nous verrons ensuite les acteurs cellulaires de cette inflammation avant de présenter les communications établies entre ces différents acteurs et les mécanismes moléculaires mis en jeu.

2.1- Les observations associant obésité/insulino-résistance et inflammation.

Les premières observations expérimentales (en 1876) permettant d’établir un lien entre insulino-résistance et inflammation furent la normalisation des paramètres métaboliques (glucosurie) chez le sujet diabétique après traitement à l’acide acétyl salicylique (Shoelson et al., 2006). On sait aujourd’hui que cette amélioration passe par l’inhibition de la voie du NFκB (Yuan and Varga, 2001). Plus tard, un nombre important d’études cliniques a présenté des corrélations positives entre l’insulino-résistance et des marqueurs inflammatoires plasmatiques comme l’interleukin 6 (IL6) ou le tumor necrosis factor α (TNFα) (de Luca and Olefsky, 2008; Kolb and Mandrup-Poulsen, 2005; Pickup and Crook, 1998). En 1993, Hotamisligil montrait que les taux circulants de TNFα ainsi que son expression dans le TA étaient augmentés chez la souris obèse et qu’une neutralisation de cette protéine améliorait l’insulino-sensibilité des animaux (Hotamisligil et al., 1993). Dans le même temps, la vision du TA a évolué et cet organe n’a plus seulement été considéré comme un organe de stockage des TG mais aussi comme un véritable organe endocrine capable de sécréter de nombreuses molécules bioactives, appelées adipokines (Galic et al., 2010). Dix ans après l’observation d’Hotamisligil, Weisberg et Xu ont mis en évidence une infiltration macrophagique au sein du TA de souris ou de patients obèses (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003). Ces observations ont permis d’effectuer un premier lien entre obésité et inflammation. Par la suite de nombreuses études ont montré l’accumulation de cellules immunes au sein du TA en présence d’obésité et une corrélation positive peut être établie entre prise de poids, accumulation macrophagique et insulino-résistance, la revue de V. Bourlier présente ces travaux (Bourlier and Bouloumie, 2009).

Diminution génique ou pharmacologique de la lipase hormono-sensible

Il est désormais admis que l’expansion de la masse grasse reliée à l’obésité s’associe avec une inflammation chronique dite « à bas bruit ».

2.2- Les acteurs cellulaires de l’inflammation du TA.

Le TA est constitué de nombreux types cellulaires, les adipocytes et pré-adipocytes représentant la majorité de ces cellules. Mais il comporte aussi une fraction non adipeuse, appelée fraction stroma-vasculaire (SVF) qui inclut des cellules immunes (macrophages, lymphocytes, cellules dendritiques…), des cellules endothéliales, des fibroblastes et des cellules dites progénitrices. Au cours de l’obésité on assiste à une augmentation des cellules immunes, par recrutement à partir de la circulation sanguine.

Les macrophages

Recrutement des macrophages

L’infiltration macrophagique du TA se fait par recrutement et différenciation de monocytes circulants. La revue de Bourlier et al. (Bourlier and Bouloumie, 2009) et des travaux récents permettent de recenser les facteurs potentiels du recrutement macrophagique au sein du TA pendant l’obésité :

- la sécrétion de facteurs chémo-attractants suite à l’hypertrophie adipocytaire. La taille adipocytaire est un déterminant majeur de la sécrétion de nombreuses cytokines par l’adipocyte. La monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1/CXCL2) est un des facteurs chémo- attractants impliqués dans le recrutement macrophagique. On observe une augmentation de l’expression et des concentrations circulantes de MCP1 pendant l’obésité (Chen et al., 2005) et la surexpression de MCP-1 spécifiquement dans le TA entraîne une augmentation de l’infiltration macrophagique ainsi qu’une diminution de la sensibilité à l’insuline chez la Souris (Kamei et al., 2006; Kanda et al., 2006). D’autre part, l’invalidation de MCP-1 (Ito et al., 2008; Kanda et al., 2006) ou de son récepteur CCR2 (Weisberg et al., 2006) chez la Souris élevée en régime gras protège de l’infiltration macrophagique et de l’insulino-résistance ; mais certains de ces résultats ont été remis en cause (Inouye et al., 2007; Kirk et al., 2008).

L’ostéopontine, adipokine nouvellement décrite, amplifie l’infiltration macrophagique stimulée par MCP-1 (Kiefer et al., 2010; Kiefer et al., 2008; Nomiyama et al., 2007). Si l’observation d’une augmentation de la macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP1α) a été plusieurs fois corrélée à celle de l’obésité, son invalidation dans un modèle murin ne protège pas de l’infiltration macrophagique du au régime gras (Surmi et al., 2010), indiquant que cette chémokine n’est pas majoritairement responsable du recrutement macrophagique. De nombreux autres facteurs (en revue dans (Bourlier and Bouloumie, 2009)) sont capables d’activer le recrutement de macrophages dans le TA [leptine, TNFα et le (C-C) motif ligand 5 (CCL5) (Keophiphath et al., 2010)].

- la mort cellulaire de type nécrotique ou apoptotique. L’expansion de la masse grasse chez l’Homme et la Souris est associée à l’apparition d’adipocytes nécrotiques (dont la perte de fonctionnalité est révélée par la disparition de l’intégrité de la GL par marquage immunohistochimique de la périlipine) (Cinti et al., 2005; Murano et al., 2008). Ces adipocytes morts sont entourés de cellules immunitaires (majoritairement des macrophages) et forment des structures en couronne (« crown like structure »). A ce jour, les mécanismes moléculaires reliant hypertrophie adipocytaire, nécrose adipocytaire, et recrutement macrophagique ne sont pas totalement connus. La mort cellulaire par apoptose est également capable de déclencher le recrutement de macrophages (Alkhouri et al., 2010). Cependant les adipocytes blancs sont relativement résistants à l’apoptose.

- la production exagérée d’AG par les adipocytes. L’hypertrophie adipocytaire entraîne, outre une libération de facteurs pro-inflammatoires, une production exagérée d’AG dont la capacité à recruter les macrophages a été mis en évidence par les modèles animaux invalidés ou mutés pour le Toll like receptor 4 (TLR4) (Kim et al., 2007; Poggi et al., 2007; Shi et al., 2006; Suganami et al., 2007a; Tsukumo et al., 2007).

- la production de vésicules exosomiques par les adipocytes qui seraient capables d’activer les macrophages résidents et de stimuler la différenciation des monocytes circulants en macrophage activés (Deng et al., 2009) Tout comme les AG, les vésicules exosomiques exercent leurs effets sur les macrophages par l’intermédiaire de la voie du TLR4 (Deng et al., 2009).

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- l’hypoxie tissulaire. L’hypoxie peut augmenter la production d’adipokines pro- inflammatoires par l’adipocyte (MCP-1, MIP-1α…) via le facteur de transcription Hypoxia-

inducible factor 1 alpha (HIF-1α) (Wang et al., 2007).

- l’endotoxémie métabolique nutritionnelle, dont l’acteur moléculaire principal est le lipopolysaccharide (LPS). Le LPS peut moduler la production de cytokines pro- inflammatoires par l’adipocyte (leptine, MCP-1) (Leuwer et al., 2009). Le revue de Li et Hotamisligil en présente les concepts (Li and Hotamisligil, 2010).

Polarisation

Par comparaison avec l’activation des lymphocytes T helper et la classification Th1/Th2, l’activation des macrophages a été définie de manière classique par les états M1 et M2 (pour revue (Olefsky and Glass, 2010)). La polarisation M1 (par des cytokines de type Th1 comme l’interféron gamma, IFNγ) confère aux macrophages un phénotype pro-inflammatoire, caractéristique des macrophages recrutés. Ces derniers ont un pouvoir inflammatoire élevé, par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires interleukines ou autres (TNFα, IL6, IL12) ou d’ERO. En opposition, les macrophages résidents du TA présentent un phénotype M2, anti- inflammatoire et seraient impliqués dans les phénomènes de réparation et de remodelage tissulaire, ils sécrètent des cytokines anti-inflammatoires, comme IL10. On parle d’activation alternative, qui est conditionnée par les cytokines de type Th2, IL4 et IL13. La désignation M2 englobe aussi d’autres phénotypes macrophagiques. Différents facteurs orientent la polarisation des macrophages. Les vésicules exosomiques produites par les adipocytes influencent la polarisation macrophagique vers le type M1 (Deng et al., 2009). L’adiponectine est capable d’induire un phénotype M2 dans le TA humain et murin (Lovren et al., 2010; Ohashi et al., 2010). D’autre part, PPARδ semble indispensable à la polarisation M2 (Kang et al., 2008; Odegaard et al., 2008). La polarisation des macrophages M2 peut également être orientée par d’autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T régulateurs (Liu et al., 2010) ou même par des cellules souches mésenchymateuses chez l’Homme (Kim and Hematti, 2009). Chez la Souris, le groupe de Saltiel a montré qu’un régime enrichi en graisse provoquait le recrutement de macrophages de type M1 (Lumeng et al., 2007b) possiblement impliqués dans l’altération de la sensibilité à l’insuline (Lumeng et al., 2007b; Nguyen et al., 2007) ainsi qu’un changement de polarisation M2 vers M1 des macrophages résidents (Lumeng et al., 2007a). Ces macrophages présentent les marqueurs de surface F4/80, CD11b

et CD11c (Strissel et al., 2007). Les macrophages du TA humain présenteraient des caractéristiques à la fois M1 et M2 (Bourlier et al., 2008; Zeyda et al., 2007; Zeyda et al., 2010).

Cependant différents travaux semblent aujourd’hui remettre en cause le dogme M1/M2 chez la Souris et décrivent l’existence de « sous-types » de macrophages, aux phénotypes intermédiaires. L’étude de différents marqueurs de surface tels que macrophage galactose-

type C-type lectin 1 (MGL1) (Shaul et al., 2010), mannose receptor (MR) (Zeyda et al., 2010)

ou CD206 (Fujisaka et al., 2009; Wentworth et al., 2010) ont permis de décrire des phénotypes mixtes au sein des classes M1 et M2. Il existerait ainsi des macrophages recrutés qui présenteraient des marqueurs de surface de type M2 (CD11+/MGL1med) ou même des macrophages recrutés CD11c-/MGL1+ (Shaul et al., 2010) ou CD11c-/MR- (Zeyda et al., 2010). Enfin, la pertinence du marqueur CD11c pour l’identification des macrophages M1 est elle aussi controversée par les récents travaux de Li et al. montrant une hétérogénéité phénotypique au sein de la population CD11c positive après passage d’un régime gras à un régime standard (Li et al., 2010b). A la vue de ces récents travaux, on voit d’autant plus l’intérêt d’une nouvelle classification des macrophages non plus sur leur phénotype M1/M2 mais sur leurs fonctions (défense, remodelage, régulation) comme l’ont proposé Mosser and Edwards (Mosser and Edwards, 2008).

Rôles des macrophages

Les macrophages pourraient être impliqués dans la prise en charges de lipides. Le fait que les macrophages soient préférentiellement observés autour d’adipocytes mourant en cours de délipidation soutiendrait cette hypothèse (Cinti et al., 2005). D’autre part, l’augmentation des capacités de stockage des lipides au sein du macrophage l’oriente vers un phénotype M2. Ainsi, la surexpression de DGAT1 chez la Souris favorise la prise de poids mais protège de l’infiltration et de l’activation des macrophages (Koliwad et al., 2010). Une surexpression spécifique de cette enzyme dans les macrophages suffit à produire les effets cités précédemment et à contrecarrer l’insulino-résistance. Les effets d’un traitement PPARγ agoniste soutiennent également cette hypothèse (Stienstra et al., 2008). Gu et al. ont récemment montré que la voie du TLR9 stimulait l’expression de TIP47, une protéine de la GL et induisait l’accumulation de lipides dans le macrophage (Gu et al., 2010).

Diminution génique ou pharmacologique de la lipase hormono-sensible

D’autre part, les macrophages pourraient être impliqués dans le remodelage du TA comme le suggèrent Strissel et al. (Strissel et al., 2007). Par leurs relations avec les préadipocytes ils favoriseraient la production de matrice extra-cellulaire menant à la fibrose bien qu’ils puissent eux-mêmes sécréter des molécules pro-fibrosantes (Bouloumie et al., 2005). Comme le rappellent Bourlier et Bouloumié, les macrophages du TA humain présentent également un phénotype pro-angiogénique favorisant le remodelage tissulaire et influencent aussi l’adipogenèse en limitant la différenciation des cellules progénitrices. Ces observations suggèrent que les capacités d’expansion du TA peuvent être en partie contrôlées par les macrophages.

Les lymphocytes

L’infiltration du TA par les lymphocytes n’a été décrite que plus récemment. Kintscher et al. ont mis en évidence la présence de lymphocytes (cellules CD4 positives) au sein du TA de sujets diabétiques, quantité corrélée avec le tour de taille des patients. De plus, des souris soumises à un régime enrichi en graisse présentent une infiltration marquée de lymphocytes T dans le TA viscéral (Kintscher et al., 2008). Cependant, l’étude des souris obèses déficientes en lymphocytes (rag-/-) (Duffaut et al., 2009b) a montré que l’absence de lymphocytes ne suffisait pas à normaliser les paramètres métaboliques comme cela avait pu être montré avec les macrophages (Patsouris et al., 2008). Chez la Souris, le développement de la masse grasse s’accompagne d’une augmentation des lymphocytes T CD8 et d’une diminution des lymphocytes T CD4 helper et lymphocytes régulateurs (Feuerer et al., 2009) suggérant alors un rôle initiateur et propagateur pour les lymphocytes T CD8 (Nishimura et al., 2009) tandis que les lymphocyte CD4 seraient plutôt protecteurs et garants de la sensibilité à l’insuline (Nishimura et al., 2009; Winer et al., 2009). L’induction des lymphocytes T régulateurs chez la souris obèse permet de diminuer l’infiltration macrophagique et le TNFα au sein du TA attribuant un rôle central à ce type cellulaire dans l’orchestration de la réponse immunitaire associée au développement de la masse grasse (Ilan et al., 2010).

Les autres types cellulaires

Les préadipocytes sont des cellules très sensibles à l’hypoxie associée à l’expansion de la masse grasse. Dans cette condition, elles sécrètent le facteur HIF-1 qui va réguler l’expression de gènes pro-inflammatoires (Wood et al., 2009). La sécrétion d’IL6 est très supérieure chez

étudié dans la genèse de l’inflammation du TA associée à l’obésité, semblent pouvoir tenir un rôle important. D’autre part, les préadipocytes seraient également victimes de l’environnement pro-inflammatoire puisque dans ces conditions leur différentiation est inhibée (Poulain-Godefroy and Froguel, 2007). Enfin, Zhou et al. ont montré que des produits dérivés de l’oxydation pouvaient activer les préadipocytes (Zhou et al., 2010).

L’équipe d’A. Bouloumié propose également une hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales pourraient être impliquées dans le processus inflammatoire. Des facteurs pro- angiogéniques pourraient faire entrer les cellules endothéliales en sénescence et entraîner leur vieillissement prématuré, ceci ayant pour conséquence d’orienter ces cellules vers un phénotype inflammatoire qui, associées aux conditions hypoxiques, favoriserait le recrutement de cellules immunes au sein du TA (Villaret et al., 2010).

La cinétique d’infiltration des cellules immunes pendant le développement de la masse grasse

Si la présence de cellules immunes a été montrée dans le cadre d’une obésité établie, qu’en est-il de la cinétique d’apparition de ces cellules au cours du développement de la masse grasse ? Différents travaux ont rapporté une apparition précoce des macrophages après la mise en régime gras (dès 8 semaines) (Strissel et al., 2010). Cependant une autre étude à montré une infiltration maximale de ces cellules après 16 semaines de régime, corrélée à la nécrose adipocytaire (Strissel et al., 2007). Concernant les lymphocytes, plusieurs travaux décrivent l’infiltration lymphocytaire avant celles des macrophages, dès 5 ou 8 semaines de régime gras (Duffaut et al., 2009b; Kintscher et al., 2008; Nishimura et al., 2009). L’étude récente de Strissel relate même une infiltration des lymphocytes encore plus tardive, vers 22 semaines de régime gras, qui serait associée au remodelage tissulaire (Strissel et al., 2010). On voit que ces résultats sont aujourd’hui très controversés et qu’ils doivent certainement être influencés par le fond génétique des animaux, le type de régime, les marqueurs de surface utilisés…

2.3- Communications intercellulaires

Le dialogue adipocyte / macrophage

Une communication de type paracrine a été décrite entre adipocytes et macrophages faisant intervenir les AG et les cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, les AG produits en excès par les

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adipocytes hypertrophiés sont capables d’activer les macrophages par la voie du TLR4 (Suganami et al., 2005). De plus, nous avons vu précedemment que des vésicules exosomiques produites par les adipocytes pouvaient participer au dialogue adipocyte/macrophage (Deng et al., 2009). En retour les macrophages sécrètent des cytokines pro-inflammatoires (TNFα) qui vont moduler le métabolisme de l’adipocyte. Un nouveau mode de communication entre macrophages et adipocytes a récemment été décrit par Kurokawa et al. faisant intervenir les protéines solubles macrophagiques AIM (Kurokawa et al., 2010). Ces dernières seraient captées par l’adipocyte par endocytose dépendante du CD36 puis inhiberaient l’activité de la fatty acid synthase (FAS), et augmenteraient la lipolyse. La Figure 24 résume des interactions.

Figure 24 : Le dialogue entre les adipocytes et les macrophages pendant l’obésité et l’insulino-résistance.

D°: degré, AIM : apoptosis inhibitor of macrophage, MCP-1: monocyte chemotactic protein

Le dialogue adipocyte / lymphocyte

Duffaut et al. proposent un dialogue entre adipocytes et lymphocytes dans lequel les cellules adipeuses par leurs sécrétions recrutent les lymphocytes T qui en retour modulent la lipogenèse (Duffaut et al., 2009b). Le recrutement des lymphocytes T CD8 par les adipocytes est également observé par Nishimura et al., ces auteurs postulent que les macrophages soient recrutés suite à ce dialogue, attribuant alors un rôle initiateur aux lymphocytes (Nishimura et al., 2009). Un contact cellule/cellule implicant la voie CD40/CD40L participerait également aux dialogues entre adipocytes et lymphocytes à l’origine de l’altération du métabolisme adipocytaire (Poggi et al., 2009).

Le dialogue préadipocyte / adipocyte / macrophage

Kurokawa et al. montrent que les protéines AIM (décrites précédemment), produites par les macrophages sont capables d’inhiber la maturation des préadipocytes (Kurokawa et al., 2010). D’autre part, l’application de milieux conditionnés de macrophages sur des préadipocytes a permis de montrer que les sécrétions macrophagiques sont capables de promouvoir un phénotype pro-inflammatoire chez les préadipocytes et d’inhiber leur différenciation (Lacasa et al., 2007). Les remaniements de la matrice extra-cellulaire semblent jouer un rôle important dans l’inhibition de la différenciation au profit de la prolifaration des préadipocytes (Keophiphath et al., 2009). Enfin, dans un environnement hypoxique, les préadipocytes sécrètent des cytokines chémoattractantes favorisant le recrutement des macrophages et l’installation de la communication paracrine entre les différents types cellulaires.

2.4- Mécanismes moléculaires

Des signaux extracellulaires à NFκκκκB

Les AG sont capables d’activer les macrophages par la voie des TLR. Les TLR sont des récepteurs trans-membranaires dont l’activation par stimulation microbienne conduit à l’activation de voies de signalisation intracellulaires participant à la production de cytokines nécessaires à la mise en place de la réponse immunitaire. Au delà de leur rôle dans l’immunité différents travaux ont impliqué les TLR dans la régulation du métabolisme énergétique, notamment par leur rôle dans le TA. En particulier TLR4 et TLR2 sont capables de lier les

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AG sécrétés en excès par les adipocytes (Suganami et al., 2007b). Les expériences d’invalidation ou de mutation du TLR4 soutiennent cette hypothèse puisque les animaux sont alors protégés de l’infiltration macrophagique et des désordres métaboliques qui y sont associés (Kim et al., 2007; Poggi et al., 2007; Shi et al., 2006; Suganami et al., 2007a; Tsukumo et al., 2007). Une délétion de Tlr4 spécifiquement dans les cellules myéloïdes confère également la même protection attestant de l’importance de cette voie de signalisation (Saberi et al., 2009). La comparaison des simples KO Tlr4 avec doubles KO Tlr4/Tlr2 (Nguyen et al., 2007) suggèrent une redondance entre les deux récepteurs. La voie du TLR4 implique également le co-récepteur CD14 dont l’importance dans l’inflammation associée à l’obésité a été révélée par les études in vivo de perte de fonction (Roncon-Albuquerque et al., 2008).

La voie du TLR4 aboutit au recrutement et à l’activation du facteur de transcription NFκB dont l’implication dans la production de cytokines pro-inflammatoire est largement reconnue, et ceci après la mise en jeu d’une cascade de phosphorylation de différentes kinases. IKKβ active les voies Janus kinase (JNK) et MEK/ERK. Les modèles animaux d’invalidation des protéines CD14 (Roncon-Albuquerque et al., 2008), IKKβ (Solinas et al., 2007), JNK1 (Arkan et al., 2005) présentant tous une diminution de l’infiltration macrophagique soutiennent cette hypothèse.

D’autre part, la liaison des cytokines sur leurs récepteurs activent ces mêmes voies de signalisation. Les voies de signalisation classiquement activées sont : NFκB, JNK, p38MAP kinases ou ERK.

Du NFκκκκB à l’insulino-résistance

Nous avons vu précédemment qu’inflammation et désordres métaboliques étaient associés. Quels mécanismes moléculaires sont mis en jeu ? En 1996, Hotamisligil démontrait que la stimulation par le TNFα menait à la phosphorylation de résidus sérines d’IRS1 et par là même à son inactivation (Hotamisligil et al., 1996). Le TNFα peut également réduire in vitro l’expression du récepteur à l’insuline, d’IRS1 et de GLUT4 (Stephens et al., 1997). D’autre part, des interactions existent entre la voie de signalisation des cytokines et celle de l’insuline (Tilg and Moschen, 2008) aboutissant principalement à l’inhibition d’IRS1 par les kinases (JNK, IKKβ). La voie du NFκB, initiée par les TLR, altère de la même manière la voie de

signalisation de l’insuline. L’entrée de glucose dans la cellule peut donc être affectée par l’activation de ces différentes voies pro-inflammatoires.

II Objectifs

Partant du constat que:

1) chez le sujet obèse et insulino-résistant, l’augmentation de la masse grasse est associée à une diminution de l’expression et de l’activité de la LHS (Jocken et al., 2007; Langin et al., 2005; Large et al., 1999)

2) les souris Lhs KO, non obèses, ne représentent pas un bon modèle d’étude des dérégulations de la LHS pendant l’obésité,

nous avons imaginé que des souris haplo-déficientes pour le gène de la Lhs (hétérozygotes Lhs, LHS+/-) rendues obèses par une intervention nutritionnelle pouvait représenter un bon modèle d’étude des dérégulations de cette lipase. Nous disposions d’autre part en collaboration avec le groupe pharmaceutique Glaxo Smith Kline d’un inhibiteur spécifique de