Induction de la différenciation mégacaryocytaire par le TPA

Nous avons montré précédemment que l’expression du gène codant pour la GSTP1-1 varie au cours de l’induction de la différenciation érythroïde des cellules K562. Pour évaluer si ces variations sont spécifiques du phénotype érythroïde, nous avons utilisé le caractère multipotent de la cellule K562 pour étudier une autre voie de différenciation. En effet, cette lignée peut également être induite à se différencier vers la voie mégacaryocytaire notamment, par le TPA, un ester de phorbol.

I. 2. 1- Effet sur la différenciation et la prolifération cellulaire

Dans nos conditions expérimentales, nous avons recherché la concentration inductrice maximale de la différenciation mégacaryocytaire des cellules K562 par le TPA. La différenciation mégacaryocytaire peut être suivie par cytométrie en flux qui permet de quantifier un marqueur de surface plaquettaire, le CD61 (ou GP IIIa).

Le taux d’expression est évalué en fonction de concentrations croissantes de TPA (0 ; 1 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 nM) après trois jours d’induction (Figure 20-A). Le nombre de cellules différenciées exprimant le marqueur CD61 est représenté en fonction de la concentration en inducteur (Figure 20-B), concentration que nous utiliserons pour la suite de cette étude. L’inhibition de croissance associée au processus de différenciation a été évaluée en parallèle (Figure 21). On peut remarquer que l’inhibition de croissance induite par le TPA atteint des valeurs élevées dès les plus faibles concentrations.

Toutefois, cette forte inhibition de croissance reste inférieure à 100 % ce qui témoigne d’un effet cytostatique du traitement par le TPA mais pas d’un effet cytotoxique.

A partir des résultats obtenus précédemment, les cellules K562 ont été traitées durant six jours par le TPA (10 nM).

L’évaluation de l’expression du marqueur CD61, au cours des 6 jours de traitement, est présentée dans la Figure 22-A. Le nombre de cellules différenciées est exprimé en fonction du taux d’expression du marqueur CD61 au cours du temps d’induction par le TPA (Figure 22-B).

A

B

Figure 20 : Quantification de la différenciation mégacaryocytaire des cellules K562 en fonction de la concentration en TPA.

Les cellules K562 sont cultivées en présence de différentes concentrations de TPA pendant 3 jours. L’expression du marqueur de surface plaquettaire CD61 est évalué par cytométrie en flux (A). Le nombre de cellules différenciées est exprimé en fonction de l’expression du marqueur CD61 spécifique de la différenciation mégacaryocytaire (B).

0 5 10 15 20 25 30 35

0 5 10 15 20 25 30

Concentration en TPA (nM)

Cellules exprimant le CD61 (%)

CD61

25 nM 30 nM

20 nM

10 nM

5 nM 15 nM

0 nM 2,5 nM 1 nM

Granularité

Figure 21 : Inhibition de croissance des cellules K562 en fonction de la concentration en TPA.

Les cellules K562 sont cultivées en présence de différentes concentrations de TPA pendant 3 jours. L’inhibition de croissance associée à la différenciation induite par le TPA est évaluée en %.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 5 10 15 20 25 30

Concentration en TPA (nM)

Inhibition de croissance (%)

A

B

Figure 22 : Pourcentage de cellules K562 exprimant le marqueur CD61 en fonction du temps de traitement au TPA.

Les cellules K562 sont cultivées en présence ou non de 10 nM de TPA pendant 1 à 6 jours.

L’expression du marqueur de surface plaquettaire CD61 est évalué par cytométrie en flux (A).

Le nombre de cellules différenciées exprimant le marqueur CD61 est représenté en fonction du temps de traitement (B).

0 10 20 30 40 50 60

0 2 4 6

Temps de traitement (jour)

Cellules exprimant le CD61 (%)

CD61

Granularité

Témoin

Jour 4

Jour 1 Jour 2

Jour 5

Jour 3

Jour 6

Le traitement des cellules K562 par 10 nM de TPA permet d’induire la différenciation mégacaryocytaire de manière dépendante du temps de traitement. Ainsi, environ 50 % des cellules sont différenciées après six jours d’induction. Cette différenciation est associée à une inhibition de croissance qui atteint des valeurs proches de 100 %.

I. 2. 2- Expression du gène de la GSTP1-1 au cours de l’induction de différenciation mégacaryocytaire par le TPA

Toutes les 24 h, les ARN totaux et les protéines cytoplasmiques ont été extraits des cellules K562 induites à se différencier par le TPA (10 nM) pendant 6 jours.

L’expression de l’ARNm de la GSTP1-1 et de la protéine a été analysée par northern blot et western blot, respectivement.

Les résultats obtenus par northern blot (Figure 23-A) montre une diminution significative de 50 à 60 % (p<0,01) de l’ARNm de GSTP1-1, quel que soit le temps d’induction par le TPA (Figure 23-B).

L’analyse par western blot (Figure 24-A) de l’expression de la protéine GSTP1-1 montre une diminution significative, pendant les trois premiers jours, d’environ 20 à 30 % (p<0,01) avec une baisse maximale de 40 % (p<0,01) après le troisième jour de traitement. A partir du quatrième jour, l’expression remonte progressivement jusqu’au sixième jour (Figure 24-B).

En conclusion, l’induction de la différenciation mégacaryocytaire par le TPA (10 nM) dans les cellules K562 montre d’une manière générale une diminution du taux d’expression de l’ARNm et de la protéine GSTP1-1.

A

Figure 23 : Expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans les cellules K562 après 1 à 6 jours d’induction de la différenciation mégacaryocytaire par le TPA.

10 µg d’ARN totaux de cellules K562 cultivées pendant 1 à 6 jours dans un milieu seul ou additionné de 10 nM de TPA , ont été analysés par northern blot et hybridés avec la sonde GSTP1-1. (A), northern blot représentatif de trois expériences indépendantes. Les ARN ribosomiques ont été colorés au bromure d’éthidium et analysés par un appareil Kodak (image station 440cf) et le signal radioactif de la sonde GSTP1-1 a été détecté par un Phosphorimager (Cyclone). Les quantifications ont été réalisées à l’aide du logiciel Kodak 1D image analysis puis rapportées à la sous-unité 18S de l’ARN ribosomique. (B), quantification de l’expression de l’ARNm de GSTP1-1. Ces données représentent la moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes. ** correspond à p<0,01 par rapport au témoin.

28 S Expression relative de l’ARNm de GSTP1-1 (U.A.)

** ** ** ** ** **

A

Jour 1 2 3 4 5 6 TPA (10 nM) - + - + - + - + - + - +

B

Figure 24 : Expression de la protéine GSTP1-1 dans les cellules K562 au cours de 1 à 6 jours d’induction de la différenciation mégacaryocytaire par le TPA.

10 µg de protéines cytoplasmiques de cellules K562, cultivées pendant 1 à 6 jours en présence ou non de 10 nM de TPA, ont été analysées par western blot (A), ces données sont représentatives de trois expériences. La chimiluminescence a été détectée avec un appareil Kodak (image station 440cf), quantifiée par le logiciel Kodak 1D image analysis (B), ces données représentent la moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes. * et **

correspondent respectivement à p<0,05 et à p<0,01 par rapport au témoin.

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