Effet des agents différenciants sur l’expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans la

Nous avons mis en évidence une variation de l’expression du gène de la GSTP1-1 qui est spécifique de la voie de différenciation induite. En effet, la différenciation des cellules K562 vers la voie érythroïde entraîne d’une manière générale une augmentation de l’expression du gène de la GSTP1-1 indépendamment du type d’inducteur utilisé (anthracyclines ou hémine). A l’opposé, l’induction de la différenciation mégacaryocytaire par le TPA, entraîne une diminution de l’expression du gène de la GSTP1-1.

Afin d’évaluer si cette modulation de l’expression du gène de la GSTP1-1 est en relation avec un processus de différenciation, nous avons étudié l’effet de ces inducteurs sur une lignée non myéloïde, la lignée humaine Jurkat (une leucémie à cellules T).

Les cellules Jurkat ont été traitées par 10 nM de TPA, 20 nM d’acla ou 40 nM de dox pendant 1 à 6 jours ou par 30 µM d’hémine pendant 1 à 3 jours.

I. 4. 1- Effet de l’hémine sur l’expression de la GSTP1-1 dans les cellules Jurkat

I. 4. 1. 1- Effet sur la différenciation et la prolifération cellulaire

L’effet du traitement par l’hémine (30 µM) a été étudié pendant 1 à 3 jours, sur l’inhibition de croissance (Figure 29-A) et le taux de mortalité cellulaire (Figure 29-B).

Les résultats montrent une inhibition de croissance qui augmente en fonction du temps de traitement et qui atteint environ 50 % au bout du troisième jour de traitement. Ce ralentissement de croissance ne s’accompagne pas d’une augmentation significative de la mortalité cellulaire (<7 % après trois jours).

Cette inhibition n’est pas la conséquence d’un effet cytotoxique du traitement, puisqu’elle reste inférieure à 100 % et est accompagnée d’un taux de mortalité qui reste faible.

A

B

Figure 29 : Effet de 30 µM d’hémine sur la prolifération cellulaire de la lignée Jurkat au cours de 3 jours de traitement.

I. 4. 1. 2- Effet sur l’expression de l’ARNm de GSTP1

Nous avons ensuite étudié l’effet de ces conditions de traitement sur l’expression de l’ARNm du gène de GSTP1-1 dans la lignée Jurkat par northern blot en présence d’une sonde radiomarquée d’ADNc de GSTP1-1 (Figure 30-A).

La Figure 30-B présente le taux d’expression relatif de l’ARNm de GSTP1-1, rapporté à celui des ARNr 18S, en fonction du temps de traitement. Cette quantification ne met en évidence aucune différence significative de l’expression de l’ARNm de GSTP1-1, pendant ce temps de traitement avec 30 µM d’hémine.

I. 4. 2- Effet des anthracyclines et du TPA sur l’expression de la GSTP1-1 dans les cellules Jurkat

I. 4. 2. 1- Effet sur la prolifération cellulaire

L’effet des trois inducteurs (acla, dox et TPA) a été analysé sur l’inhibition de croissance (Figure 31-A) et le taux de mortalité cellulaire (Figure 31-B) des cellules Jurkat.

Les résultats montrent une forte inhibition de croissance (85 %) dès le deuxième jour de traitement par la dox qui se maintient jusqu’au sixième jour. Cette inhibition n’est pas la conséquence d’un effet cytotoxique, puisque le taux de mortalité cellulaire reste faible jusqu’au quatrième jour. Au delà, l’effet cytotoxique devient significatif (>10%) avec les différents inducteurs. Toutefois, nous remarquons aussi une augmentation plus modérée de la mortalité cellulaire dans les cultures témoins.

Après les traitements par l’acla et le TPA, on constate également un ralentissement de la croissance cellulaire mais beaucoup plus faible que celui observé avec la dox (20 et 40 % respectivement).

A Jour 1 2 3 Hémine (30 µM) - + - + - +

B

Figure 30 : Expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans les cellules Jurkat après 1 à 3 jours de traitement par 30 µM d’hémine.

10 µg d’ARN totaux de cellules Jurkat traitées pendant 1 à 3 jours par 30 µM d’hémine ont été analysés par northern blot et hybridés avec la sonde GSTP1-1. (A), northern blot représentatif de trois expériences indépendantes. Les ARN ribosomiques ont été révélés au bromure d’éthidium et analysés par un appareil Kodak (image station 440cf) et le signal radioactif de la sonde GSTP1-1 a été détecté par un Phosphorimager (Cyclone). Les quantifications ont été réalisées à l’aide du logiciel Kodak 1D image analysis puis rapportées à la sous-unité 18S de l’ARN ribosomique. (B), quantification de l’expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans les cellules Jurkat traitées pendant 3 jours par rapport au témoin correspondant. Ces données représentent la moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

1 2 3

Témoin Hémine

Expression relative de l’ARNm de GSTP1-1 (U.A.)

Temps de traitement (jours)

28S 18S

ARNr

GSTP1-1 (1,2 kb)

A

B

Figure 31 : Effet des inducteurs de la différenciation de la lignée K562 sur la prolifération cellulaire de la lignée Jurkat au cours de 6 jours de traitement.

Les cellules Jurkat ont été cultivées pendant 1 à 6 jours dans du milieu seul ou additionné de 10 nM de TPA, 20 nM d’acla ou 40 nM de dox. L’inhibition de croissance (A) et la mortalité cellulaire (B) ont été évaluées par numération des cellules au bleu trypan. Ces données représentent la moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes.

0

Inhibition de croissance (%)Mortalité cellulaire (%)

0

I. 4. 2. 2- Effet sur l’expression de l’ARNm de la GSTP1-1 Nous avons analysé l’expression de l’ARNm du gène de GSTP1-1 dans la lignée Jurkat traitée pendant 6 jours par 10 nM de TPA, 20 nM d’acla ou 40 nM de dox. L’analyse par northern blot de 10 µg d’ARN totaux hybridés avec la sonde d’ADNc de GSTP1-1 radiomarquée est présentée dans la Figure 32-A.

La Figure 32-B présente le taux d’expression relatif de l’ARNm de GSTP1-1, rapporté à celui des ARNr 18S, en fonction du temps de traitement. Cette quantification ne met en évidence aucune différence significative de l’expression de l’ARNm de GSTP1-1, que ce soit en fonction du temps de traitement ou du type d’inducteur.

En conclusion, les traitements capables d’induire la différenciation des cellules K562 vers la voie érythroïde ou mégacaryocytaire ne modifie pas l’expression du gène de la GSTP1-1 dans une lignée incapable de se différencier vers ces voies. Ainsi, les variations de l’expression du gène de la GSTP1-1 pourraient être spécifiques des potentialités de différenciation de la lignée K562.

A Jour 1 2 3 4 5 6

B

Figure 32 : Effet des inducteurs de la différenciation de la lignée K562 sur l’expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans la lignée Jurkat au cours de 6 jours de traitement.

10 µg d’ARN totaux de cellules Jurkat traitées pendant 1 à 6 jours par 10 nM de TPA, 20 nM d’acla ou 40 nM de dox, ont été analysés par northern blot et hybridés avec la sonde GSTP1-1 (A). Northern blot représentatif de trois expériences indépendantes. Les ARN ribosomiques ont été colorés au bromure d’éthidium et analysés par un appareil Kodak (image station 440cf) et le signal radioactif de la sonde GSTP1-1 a été détecté par un Phosphorimager (Cyclone). Les quantifications ont été réalisées à l’aide du logiciel Kodak 1D image analysis puis rapportées à la sous-unité 18S de l’ARN ribosomique. (B), quantification de l’expression de l’ARNm de GSTP1-1 dans les cellules Jurkat traitées pendant 6 jours par rapport au témoin correspondant. Ces données représentent la moyenne ± l’écart-type de trois expériences indépendantes. Expression relative de l’ARNm de GSTP1-1 (U.A.)

Témoin

En résumé, dans la lignée K562, l’expression du gène de la GSTP1-1 varie en fonction de la voie de différenciation induite.

Les anthracyclines et l’hémine qui induisent la différenciation érythroïde de ces cellules conduisent à une augmentation de l’ARNm et de la protéine GSTP1-1.

Au contraire, lors de la différenciation mégacaryocytaire induite par le TPA, la GSTP1-1 devient très faiblement exprimée.

Avec le butyrate les résultats semblent moins contrastés. En effet, nous pouvons observer une diminution de l’expression comme dans le cas du TPA avec la concentration de 2 mM de butyrate qui induit la différenciation mégacaryocytaire. En revanche, avec la concentration de 1 mM, qui induit la différenciation érythroïde, l’expression de la GSTP1-1 est également diminuée mais de manière moins importante et plus tardive qu’avec la concentration de 2 mM.

Ces résultats suggèrent l’existence d’un mécanisme de régulation transcriptionnel et / ou post-transcriptionnel du gène GSTP1 spécifique de la voie de différenciation induite.

De plus, ce mécanisme de régulation transcriptionnel semble spécifique de la lignée et donc du type cellulaire considéré, puisque les traitements capables d’induire la différenciation des cellules K562 vers les voies érythroïde et mégacaryocytaire n’activent pas de mécanisme de régulation transcriptionnelle de l’expression du gène de la GSTP1-1 dans la lignée Jurkat qui est incapable de se différencier. Ainsi, l’effet observé en plus d’être spécifique de la voie de différenciation induite, est spécifique de la lignée cellulaire.

Ces résultats laissent ainsi envisager une implication potentielle de facteurs et de voies de signalisation qui sont spécifiques de la lignée K562.

II- ETUDE DE LA REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DE LA GSTP1-1 AU