Inducteurs de la NETose

Le PMA (un agoniste de la PKC) et les ionophores de Ca²⁺ ont eu un rôle historique dans la compréhension fonctionnelle du système immunitaire. Depuis le début des années 1970, ces molécules ont été utilisées en tant que stimulus de substitution qui imitent les signaux induits par les microbes et les produits immunitaires, simplifiant l'étude des mécanismes et des voies d'activation immunitaire (Luckasen et al., 1974; Zucker et al., 1974). Sur les PNN, le PMA active la production de ROS via la NADPH oxydase et induit la dégranulation (Bentwood and Henson, 1980; Repine et al., 1974), mais n'a aucun effet sur le Ca²⁺ intracellulaire pendant leur activation (Gennaro et al., 1984; Mahomed and Anderson, 2000).

En revanche, les ionophores de calcium induisent également la dégranulation des PNN (Wright et al., 1977), mais leur effet sur l’activité de la NADPH oxydase est extrêmement faible par rapport au PMA (McPhail et al., 1981). En raison de leur fonctionnalité divergente, PMA et ionophore sont généralement utilisés en combinaison pour atteindre une réponse cellulaire maximale qui nécessite un taux élevé de Ca²⁺ intracellulaire et une activation de PKC (Clevers et al., 1985; Josimovits et al., 1985).

Bien qu'un grand nombre de stimuli avec un potentiel biologique pertinent ont été proposées pour induire la NETose, les mécanismes sous-jacents pour la majorité de ces stimuli n'ont pas été élucidés. Au lieu de cela, les études se sont concentrées sur la compréhension des voies utilisées par PMA et ionophore de calcium pour induire des NET, en supposant que ces

146 mécanismes sont analogues à la NETose in vivo. Les voies biochimiques activées par des stimuli immunitaires et microbiens, ne sont cependant, pas complètement reproduites par le PMA ou l’ionophore de calcium. Les stimuli tels que IL-8 et LPS, initialement utilisé pour démontrer que les NET ne sont pas simplement un artefact du traitement au PMA, ne sont ni efficaces dans la production de ROS (comme vu avec PMA) ni dans l’augmentation de Ca²⁺ intracellulaire (analogue aux ionophores de calcium) (Brandolini et al., 1996; Guichard et al., 2005). Le mécanisme précis de l'induction de NET avec à la fois IL-8 et LPS est inconnu, et leur capacité à reproduire de manière fiable la NETose est discutable. D’autres facteurs solubles, tels que le TNF-α (Li et al., 2010; Neeli et al., 2009), ont des limitations similaires dans l'explication de l'induction des NET (Yuo et al., 1989).

L'importance potentielle des NET en biologie humaine est soutenue par l'induction directe de la NETose par des agents pathogènes. Les champignons Candida albicans et Aspergillus

fumigatus semblent être des agents pathogènes modèles et idéaux pour activer

systématiquement la NETose via la NADPH oxydase, la MPO, et la NE, utilisant ainsi un mécanisme similaire au PMA (Metzler et al., 2011; Röhm et al., 2014; Urban et al., 2006).

S. aureus a été utilisé comme organisme modèle pour démontrer la formation bactérienne de

NET par les deux voies NADPH oxidase dépendantes (PMA-like) et indépendantes (Fuchs et al., 2007; Pilsczek et al., 2010), mais aussi pour induire la NETose "vital", une description morphologique choisie pour mettre en évidence que les PNN restent "vivants" après avoir libéré des structures semblables aux NET (Yipp and Kubes, 2013; Yipp et al., 2012).

D'autres espèces bactériennes ont été utilisées. Par exemple, l’induction de NET par

Klebsiella pneumoniae exige la présence de MPO et NE chez la souris (type PMA)

(Papayannopoulos et al., 2010). Cependant, l'induction de NET par K. pneumoniae in vitro n’a pas pu être reproduite (Branzk et al., 2014). Par contre, dans le cas de Shigella flexneri et du streptocoque pyogenes du groupe A, c’est PAD4 qui est indispensable pour la NETose (Li et al., 2010), mais le mécanisme par lequel PAD4 est activé n’est pas clair. En effet, il a été proposé que seuls les grands pathogènes tels que les hyphes de C. albicans et les agrégats bactériens ont la capacité d’induire la NETose (Branzk et al., 2014). La mauvaise reproductibilité de la formation de NET par certains stimuli biologiquement pertinents et la compréhension limitée de ces divergences peuvent expliquer pourquoi le PMA et les ionophores de calcium restent les principaux outils dans l'étude des NET.

Plusieurs études ont rapporté l'implication de la PAD4 dans la formation de NET (Leshner et al., 2012; Li et al., 2010). PAD4 appartient au groupe d’enzymes dépendantes de Ca2+ et est située dans le noyau et les granules de PNN (Kearney et al., 2005; Nakashima et al., 2002).

147 L'enzyme est impliquée dans la citrullination des histones H2/H3/H4, qui est une modification post-traductionnelle convertissant le résidu arginine en citrulline pour former un groupe carbonyle (Arita et al., 2006; György et al., 2006). La conversion de l’arginine chargée positivement en chaînes latérales neutres de citrulline affecte la stabilisation des protéines (histones) sur l’ADN et conduit à la décondensation de la chromatine et à la libération de NET (Neeli et al., 2008; Wang et al., 2009). En conséquence, l'inhibition chimique de PAD4 en utilisant la Cl-amidine altère la NETose dans des modèles animaux de maladie anti-GBM (anti-membrane basale glomérulaire) ou de néphrite lupique (Knight et al., 2013; Kumar et al., 2015). D’ailleurs, les souris déficientes en PAD4, qui sont incapables de générer des NET (Wang et al., 2009), sont plus sensibles aux infections bactériennes.

Cependant, l’implication de PAD4 dans la formation de NET est une question discutée en raison des effets non spécifiques de Cl-amidine pour PAD4 (Causey et al., 2011; Knuckley et al., 2010).

Par exemple, les souris PAD4^-/- présentaient une formation de NET altérée au cours de la fasciite nécrosante (Li et al., 2010) mais ont succombé à une pneumonie grippale (Hemmers et al., 2011), qui impliquait des NET induits par le virus de la grippe (Narasaraju et al., 2011). Alors qu’une autre étude utilisant des souris avec la même déficience n'a pas révélé de différences de morbidité ou de mortalité par rapport à des souris sauvages dans un modèle de péritonite (ponction ligation caecale) (Martinod et al., 2015).

Ces disparités suggèrent que l'implication de PAD4 dans la formation de NET dépend du stimulus. En effet, il est montré que certains stimuli, par exemple les ionophores de calcium, activent PKC-ζ, qui abouti à l’activation de PAD4 ; alors que le PMA active la PKC-α et, par conséquent, inhibe PAD4 (Radic and Neeli, 2013) ; tandis que les deux stimuli induisent la libération de chromatine. Néanmoins, il existe également des études qui rapportent la présence de dépôts d'histones citrullinées dans des NET après stimulation par PMA (van der Linden et al., 2017; Martinod et al., 2016).

Il est possible que la NETose diffère entre l’homme et la souris, c’est pour cela qu’on suppose actuellement que PAD4 est en partie activé mais pas nécessaire lors de la NETose chez l’homme.

Une autre enzyme requise pour former des NET est une sérine protéase : la NE. Le mécanisme proposé pour son action est la dégradation spécifique des histones qui déstabilise la chromatine (Papayannopoulos et al., 2010). En outre, le blocage de la formation de NET a également été démontrée in vivo sur des souris NE-KO infectées par des bactéries Gram négatives(Farley et al., 2012) ou positives(Kolaczkowska et al., 2015). En outre, l'utilisation

148 de l'inhibiteur de NE a conduit à l'inhibition de la formation de NET induite par C. albicans (Papayannopoulos et al., 2010) et lors de thrombose stérile chez des souris KO-NET, seuls 20% des PNN produisent des NET (Martinod et al., 2016).

Cela indique que le PAD4 et la NE sont impliqués dans la formation de NET, mais pourrait être plus ou moins redondant en fonction de l'état de la maladie et/ou des stimuli. Par exemple, pendant la septicémie par S. aureus, les PNN NE^-/- n'ont pas produit de NET alors que quelques PNN PAD4-/- (environ 20%) le font (Kolaczkowska et al., 2015), alors que pendant la thrombose veineuse profonde, 80% des PNN NE^-/- produisent des NET (Martinod et al., 2016) mais aucune structure de ce type n’a été libérée par les cellules PAD4 -/-(Martinod et al., 2013). Ces résultats reflètent bien la diversité des types de NET, qui varient non seulement dans leur apparence, dans les molécules et voies impliquées mais aussi dans les conséquences pour les cellules productrices.