Dégranulation

La dégranulation accompagne la stimulation des PNN. Une stimulation d’intensité moyenne induit une dégranulation limitée aux granules spécifiques, alors que la stimulation intense que représente la phagocytose implique également les granules azurophiles, qui contiennent la plupart des hydrolases et des polypeptides cationiques bactéricides (Xu X. and Håkansson L., 2002).

Les PNN stockent des protéinases et des peptides antimicrobiens dans des granules qui fusionnent avec le phagosome pendant l'absorption du pathogène. La fusion des granules avec la membrane plasmique, provoquant une libération extracellulaire du contenu.

126 La fusion des vésicules sécrétoires avec la membrane plasmique conduit à la présentation des récepteurs d'adhésion et chimiotactiques qui favorisent le recrutement des PNN. La mobilisation de granules tertiaires et secondaires au cours de la transmigration peut faciliter la dégradation du collagène dans la membrane basale et donc l'élimination d'une barrière physique pour la migration des PNN (Mayadas et al., 2014).

La dégranulation fait intervenir deux grands mécanismes : d'une part le déversement du contenu granulaire, d'autre part, l'augmentation de l'expression de certaines protéines (comme les récepteurs CXCR1 et 2 et les intégrines) au niveau de la membrane cytoplasmique du PNN (Hartl et al., 2008). Les granules des PNN contiennent une multitude de composants. Certains d'entre eux peuvent être bactériostatiques (c'est-à-dire empêchez la croissance microbienne) et d’autres ont des activités antimicrobiennes, principalement des peptides cationiques (α-défensines) et des cathélicidines (Teng et al., 2017). Les peptides antimicrobiens cationiques fournissent une activité microbicide par interaction avec les composants membranaires chargés négativements des pathogènes, entraînant la formation de pores, l'induction de perméabilisation membranaire non spécifique, la liaison aux cibles intracellulaires pour inhiber la biosynthèse de l'ADN et/ou de l'ARN et la perturbation des bio-films bactériens. Le LL-37 est le mieux étudiée (Mayadas et al., 2014).

Outre leur activité antimicrobienne directe, de nombreux peptides antimicrobiens (en particulier LL-37) ont également des fonctions immunomodulatrices claires telles que la stimulation de la chimiotaxie des PNN, l'induction de l'expression des récepteurs de chimiokines, l'induction de la production de cytokines et la suppression de l'apoptose des PNN. LL-37 peut également potentialiser les fonctions d'autres cellules immunitaires, telles que les DC (Lande et al., 2007).

D'autres composants des granules des PNN ne sont pas directement antimicrobiens, et il se peut que ceux-ci (tels que les hydrolases acides qui dégradent les hydrates de carbone, les protéines et les acides nucléiques) interviennent dans la digestion des organismes tués, plutôt que dans leur destruction. De ce fait, le contenu des granules des PNN peut être considéré comme la pierre angulaire de l'immunité innée.

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(iii) Présentation antigénique

Bien que toujours débattues, plusieurs études ont mis en avant l’expression ou la production par les PNN de molécules de surface impliquées dans la présentation antigénique (Fanger et al., 1997; Sandilands et al., 2006). Ces observations soutiennent un possible rôle des PNN en tant que cellule présentatrice d’antigène.

L'hypothèse selon laquelle les PNN peuvent acquérir cette fonction repose sur les observations selon lesquelles des molécules de CMH-II et de co-stimulation (CD80 ou CD86) peuvent être induites à leur surface cellulaire après exposition à des cytokines spécifiques telles que l’IFN-γ ou le GM-CSF (Gosselin et al., 1993). En outre, il a été démontré que ces leucocytes acquièrent la capacité de stimuler les LT d'une manière dépendante du CMH-II (Radsak et al., 2000).

De plus, Matsushima et al. ont montré que les PNN issus de moelle osseuse humaine et murine exposés au GM-CSF peuvent se différencier en des hybrides PNN-DC, présentant un phénotype de DC et une fonction de présentation d'antigène, tout en conservant plusieurs caractéristiques des PNN (Matsushima et al., 2013). Ce résultat a été confirmé par d’autres études montrant que les PNN immatures (précurseurs) et matures chez la souris et l’homme acquièrent ces caractéristiques de DC après exposition aux cytokines (GM-CSF, IFN-γ, IL-4, et TNF) (Iking-Konert et al., 2001a; Oehler et al., 1998). Par conséquent, la plasticité des PNN et leur capacité à devenir des CPA peuvent ne pas être limitées à un stade particulier de différenciation. En plus, cette plasticité à été observé en dehors des conditions de cultures in

vitro car des PNN isolés de patients recevant un traitement par GM-CSF ou IFN-γ ont montré

une expression non négligeable du CMH-II (Mudzinski et al., 1995; Reinisch et al., 1996) et il en est de même pour les PNN issus de patients atteints de maladies chroniques associées à des niveaux élevés de cytokines ; telles que la PR ou la granulomatose de Wegener (Cross et al., 2003; Iking-Konert et al., 2001b).

De plus, plusieurs études ont souligné le fait que les LT seraient responsables de cette différenciation des PNN en CPA, comme montré par les travaux de Radsak et al. Lors de la culture des LT avec des PNN, ces dernièrs acquièrent l’expression de CD80 et CD86. Par ailleurs, il faut noter qu’à leur tour les PNN permettent la prolifération et la sécrétion de cytokines par les LT (IFN-γ, IL-2, TNF) (Müller et al., 2009; Radsak et al., 2000; Vono et al., 2017).

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(iv) Résolution de l’inflammation

Classiquement comme décrite par Serhan et al. la résolution de l’inflammation nécessite avant tout une réduction du nombre de PNN des sites inflammatoires locaux, tout en augmentant le recrutement des monocytes qui se différencient en MФ pour phagocyter les PNN apoptotiques (Serhan et al., 2008).

Ainsi, nous en savons beaucoup sur les fonctions pro-inflammatoires des PNN mais qu’en est-il de leur rôle dans la résolution de l’inflammation ? Ces dernières années plusieurs études on mis en avant le rôle de ces leucocytes dans la réparation mais aussi la régénération tissulaire.

Cette fonction peut se traduire par exemple par la production de cytokine anti-inflammatoire telle que l’IL-10 qui a été observée lors des études de De Santo et al. après stimulation des PNN par de la protéine sérum amyloîde A (SAA) (Santo et al., 2010), mais aussi dans des modèles murins en réponse à différents stimuli tels que le LPS et l’IFN-γ (Romani et al., 1997), le virus de la rougeole (Hoffman et al., 2003) ou encore lors d’une septicémie (Kasten et al., 2010).

Cependant, a ce jour cette sécrétion reste controversée, car plusieurs études dont celle de Davey et al. en 2011 ont montré que suite à une stimulation par LPS ou SAA les PNN ne produisent pas d’IL-10 (Davey et al., 2011), suggérant que la possible sécrétion observée serait du à une contamination par les monocytes.

Cette même équipe confirme ce dernier résultat en démontrant que le gène de l’IL-10 est inactif, que ce soit sur des PNN stimulés ou pas par LPS (Tamassia et al., 2013).

Par ailleurs, la situation chez la souris peut être différente car la même année Ocuin et al. montrent que le transfert de PNN de souris sauvages dans un modèle murin de septicémie réduisait l’expression de TNF et d’IL-6 par les monocytes, contrairement aux transfert de PNN de souris IL-10-/- (Ocuin et al., 2011) et en 2009, Zhang et al. ont montré que les PNN murins dans un contexte d’infection bactérienne sont sécrètent d’importantes quantités d’IL-10 (Zhang et al., 2009a).

Le concept selon lequel les PNN ne sont pas seulement des effecteurs de l'inflammation de courte durée mais ont des actions homéostatiques à long terme gagne du terrain. Par exemple, les corps apoptotiques des PNN reprogramment les MФ M1 en un phénotype M2 anti-inflammatoire via l'efférocytose, et la déplétion des PNN dans les modèles murins de colite ulcéreuse conduit à une exacerbation de la maladie (Campbell et al., 2014). De plus, dans le cas de la PR, Headland et al. montrent que le liquide synovial est riche en microvésicules issues des PNN et que chez les souris avec un défaut de production de ces microvésicules

129 l’érosion du cartilage est plus importante que celle observée chez les souris sauvages. De plus, une protection du cartilage est observée lors de l’administration de ces microvésicules à des souris dans le modèle d’arthrite K/BxN (Headland et al., 2015).

(h) Exemples de pathologies associées aux PNN

(i) Athérosclérose

L'athérosclérose est une maladie chronique qui résulte du dépôt de lipides pro-inflammatoires dans le système vasculaire, ce qui entraîne une inflammation mal contrôlée des vaisseaux sanguins (Galkina and Ley, 2009). Jusqu'à récemment, on parlait surtout du rôle des cellules spumeuses et la contribution potentielle des PNN était largement négligée dans cette maladie, car ils n'étaient pas détectés dans les lésions athérosclérotiques. Cependant, des méthodes immunohistochimiques plus sensibles avec des marqueurs restreints aux granulocytes ont permis de détecter les PNN dans les lésions athérosclérotiques précoces et plus développées chez l'homme et dans des modèles murins (Drechsler et al., 2011; Leeuwen et al., 2008). Les ROS générées par les PNN qui favorisent l'apoptose des cellules endothéliales, l’oxydation des lipoprotéines de basse densité et la peroxydation lipidique peuvent favoriser le développement des lésions (Packard et al., 2009). De nombreuses protéines granulaires des PNN, y compris l'azurocidine, le LL-37 et les α-défensines, se retrouvent également dans les lésions arthériosclérotiques humaines, suggérant que les PNN activés peuvent contribuer directement au développement des lésions (Edfeldt et al., 2006; Lee et al., 2002). Les PNN peuvent également favoriser la dégradation de la matrice par la PR3 et les MMP, conduisant à un affaiblissement de la coiffe fibreuse sur les lésions artériosclérotiques vasculaires (Soehnlein, 2012). De plus, la neutropénie induite par un déficit en CXCR2 entraîne une réduction de la taille des lésions (Boisvert et al., 2006), alors qu'une neutrophilie déclenchée par une perturbation de l'axe CXCR4/CXCL12, entraîne une augmentation des dommages athérosclérotiques (Zernecke et al., 2008). En plus du rôle des PNN dans l'initiation et la progression des lésions athérosclérotiques, la présence chronique de PNN dans ces lésions peut contribuer à la thrombose, l'infarctus du myocarde et l'accident vasculaire cérébral, car la formation de NET et les sérines protéases favorisent la croissance du thrombus. Le dépôt de plaquettes activées dans la paroi des vaisseaux attire les PNN par l’expression de la P-sélectine ou la production de chimiokines telles que CCL5. Les souris génétiquement déficientes en ces molécules, et celles déficientes en plaquettes, développent moins de lésions athérosclérotiques (Collins et al., 2000).

130 Comme illustré en Figure 26, les PNN peuvent participer autrement à la pathogénèse de l’athérosclérose est ceci par l’extériorisation des NET. Ces structures en forme de filet sont détectées dans des lésions athérosclérotiques chez l'homme et la souris. D'un point de vue fonctionnel, il a été montré que les NET induisent l'activation des cellules endothéliales, des CPA et des plaquettes, ce qui entraîne une réponse immunitaire pro-inflammatoire. Ceci suggére que ces filaments d’ADN ne sont pas seulement présents dans les plaques et le thrombus, mais qu'ils peuvent aussi jouer un rôle causal dans le déclenchement de la formation de la plaque d’athérome et de la thrombose (Döring et al., 2017).

Les résultats de l’étude de Knight et al. soulignent l'importance des NET dans le développement des lésions athérosclérotiques en montrant que l'inhibition de PAD4 par le traitement à la chloramidine prévient la formation de NET, diminuant ainsi la taille des lésions d’athérome et retardant la thrombose de l’artère carotide chez un modèle murin d'athérosclérose. (Knight et al., 2014).

De même, l’équipe de Papayannopoulos trouvent que les cristaux de choléstérol déclanchent la libération de NET par les PNN. Les NET par la suite “priment“ les MФ pour produire de l’IL-1β, ce qui entraîne l'activation d'une réponse Th17, qui amplifie encore le recrutement des cellules immunitaires dans les lésions d’athérome. De plus, ils rapportent une diminution de la croissance de la plaque d’athérome chez un modèle d’athérosclérose murin où les souris sont traitées à la DNAse pour dégrader les NET confirmant ainsi l’implication des NET dans cette pathologie (Warnatsch et al., 2015).

131 Figure 26 : Rôle des PNN dans l’athérosclérose (Döring et al., 2017)

IL : Interleukine, MMP : Métalloprotéinases matricielles, MPO : Myélopéroxydase, NET :

“ Neutrophil Extracellular Traps“, ROS : Espèces réatives de l’oxygène, TNF : Facteur de nécrose tumorale.

(A) Les neutrophiles activent les leucocytes, les plaquettes et les cellules endothéliales en créant un milieu pro-inflammatoire entraînant vraisemblablement un dysfonctionnement endothélial, déclencheur initial du développement de la lésion. (B/C) Les NETs peuvent initier une réponse interleukine-1β / Th17 (T helper 17) et IFN de type I, ce qui conduit à une activation supplémentaire des leucocytes lésionnels, libérant plus de médiateurs pro-inflammatoires. (D/E) En outre, on peut supposer que les réponses pro-inflammatoires entraînées par le NET provoqueront un environnement inflammatoire qui favorise la déstabilisation et la rupture de la plaque d’athérome. Au cours de l'athérothrombose, les NET peuvent déclencher l'activation de la cascade de la coagulation et augmenter la stabilité du thrombus, orchestrant ainsi l'occlusion artérielle.

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(ii) Polyarthrite rhumatoïde

La PR est une maladie dans laquelle la synoviale est chroniquement enflammée. Dans le tissu synovial on retrouve des lymphocytes et des MФ activés, et le liquide synovial contient des PNN en abondance. La présence de PNN et de MФ dans l'articulation enflammée soulève la possibilité que les ROS soient responsables en partie des dommages subis dans la PR.

La preuve directe que cela est le cas a été obtenue en recherchant les traces de dommages oxydatifs dans les tissus et les fluides des articulations touchées (Babior, 2000).

La présence de groupement carbonyle sur les protéines reflète qu’elles ont subit des dommages oxydatifs et les protéines dans le liquide articulaire des patients atteints de PR ont une teneur accrue en groupes carbonyles, indiquant que l'articulation a subi des dommages par des ROS (Chapman et al., 1989). La nitritation des tyrosines est un autre marqueur des dommages oxydatifs, indiquant que le NO et l’O2^- ont été libérés à proximité des protéines nitritées. Ces tyrosines modifiées ont été retrouvées dans le LS de patients PR, mais pas chez des DS ou des patients souffrant d'OA (Kaur and Halliwell, 1994). Enfin pour compléter ces faits, il a été démontré que dans deux modèles murins d'arthrite auto-immune, la superoxyde dismutase améliore la maladie (Kakimoto et al., 1993; Parizada et al., 1991). Alors que le transfert de sérum KBxN à des souris déficiente en PNN soit génétiquement (souris Gfi^-/-) (Monach et al., 2010), ou par blocage du Ly6G (Anti-LyG6) (Wang et al., 2012) n’induit par d’arthrite.

Les PNN des fluides synoviaux des patients atteints de PR montrent également une augmentation de la production d'O2^-, probablement à cause de leur exposition aux cytokines présentes dans les LS (Dewar and Harth, 1994; Oishi et al., 1990; Robinson et al., 1993). Le fer, catalyseur de la production de radicaux hydroxyles à partir d’H2O2, est présent en plus grande quantité dans les LS et les tissus des patients atteints de PR (Babior, 2000). Tout cela démontre que les ROS produits par les PNN sont des médiateurs importants dans la pathogenèse de la PR (Figure 27).

Pendant de nombreuses années, on pensait que la contribution majeure des PNN à la pathologie des maladies inflammatoires comme la PR était leur libération de produits cytotoxiques. Cependant, les PNN sont maintenant reconnus pour avoir un rôle actif dans l'orchestration de la progression de l'inflammation, en régulant les fonctions des autres cellules immunitaires (Mantovani et al., 2011). Cette régulation est médiée par quatre méthodes principales : la sécrétion d'une large gamme de cytokines et de chimiokines qui peuvent réguler la fonction de presque toutes les autres cellules immunitaires ; la présentation antigénique ; les interactions cellule-cellule qui permettent, par exemple l'activation de

133 cellules NK ; et la libération de protéases qui peuvent activer ou désactiver les cytokines et les chimiokines. Nous verrons dans le Chapitre C : NETose que les NET jouent aussi un rôle important.

Des différences frappantes dans l'expression des gènes et des protéines existent entre les PNN du sang périphérique des patients atteints de PR et leurs homologues sains, y compris des taux plus élevés de TNF (Wright et al., 2011) et de myéloblastine dans la PR. Les PNN activés sont présents en grand nombre à la fois dans le LS de PR et dans le pannus (Wittkowski et al., 2007). Les PNN du LS de PR sécrètent un répertoire de cytokines et de chimiokines, y compris RANKL (Poubelle et al., 2007), BLyS et IL-17 (Moran et al., 2011) , impliqués dans l'activation des ostéoclastes, des LB et des MФ respectivement. De plus, les PNN du LS de PR peuvent exprimer les molécules du CMH de classe II, comme illustré en Figure 27, et présenter l'Ag aux LT, une fonction immunitaire qu'ils partagent avec les MФ et les DC. Les conditions dans l'articulation synoviale, telles que l'hypoxie (Cross et al., 2006) et la présence de cytokines anti-apoptotiques (comme le TNF, le GM-CSF et l'IL-8) (Lally et al., 2005; Parsonage et al., 2008) augmentent la survie des PNN jusqu'à plusieurs jours (Raza et al., 2006; Weinmann et al., 2007). En particulier, les PNN se trans-différencient en DC dans la PR (Iking-Konert et al., 2005), démontrant une plasticité.

Les PNN sont activés dans l'articulation PR par des CI (contenant le FR) (Rollet-Labelle et al., 2013), à la fois dans le LS et sur la surface du cartilage articulaire. Ces complexes engagent le FcγR et déclenchent ainsi leur activation (Nurcombe et al., 1991; Quayle et al., 1997; Robinson et al., 1994). Une fois activés, les PNN provoquent des dommages au tissu hôte par dégranulation et libération de ROS, soit dans le LS, soit directement à la surface de l'articulation. Le dépôt de CI sur la surface articulaire entraîne une phagocytose frustrée et fournit un microenvironnement dans lequel les PNN libèrent des concentrations élevées d'oxydants et d'agents cytotoxiques directement sur la surface du cartilage articulaire (Hallett and Lloyds, 1995).

Les protéines des granules des PNN sont présentes en concentrations élevées dans le LS de patients PR et peuvent être responsables de lésions du cartilage et des tissus, de l'inhibition de la prolifération et de l'invasion des chondrocytes (Baici et al., 1982; Khandpur et al., 2013; Pham, 2006; Wang et al., 2011a). Les concentrations de calgranuline dans le LS sont corrélées positivements avec le nombre de PNN (Baillet et al., 2010) et des concentrations élevées de ces facteurs induisent la libération de protéases par les différents granules des PNN (granules spécifiques, granules gélatinase, ainsi que des vésicules sécrétoires) (Simard et al., 2010). Ces proéases peuvent, par exemple, dégrader les cytokines ou activer leurs précurseurs. De manière intéressante, de nombreuses cytokines et chimiokines connues pour

134 être des chimioattractifs ou des activateurs des PNN sont également des cibles pour les protéases dérivées de ces cellules, suggérant l'existence d'une rétroaction régulatrice (Eyles et al., 2006). Les médiateurs immunitaires produits par les PNN dans un scénario inflammatoire peuvent ainsi activer les PNN ou d'autres cellules immunitaires (Hoshino et al., 2008), déclenchant principalement des rétroactions régulatrices positives, pour lesquelles le résultat est une inflammation aiguë et persistante.

Une autre observation intéressante est que les PNN qui sont recrutés au niveau des articulations enflammées et qui sont en contact avec les cellules endothéliales induisent la production de TNF, qui conjointement avec l'IL-10, induit la production de CCL18 (Auer et al., 2007), une chimmiokine qui attire les LT.

Une constatation particulière relative au rôle prédominant des PNN dans le déclenchement de la PR provient des modèles murins de la maladie qui ont montré que les protéines citrullinées existent dans les articulations enflammées et que les PNN infiltrés expriment l'enzyme PAD4, responsable de la citrullination d'arginine (Vossenaar et al., 2003). Les auto-Ac contre les peptides citrullinés sont présents dans la phase précoce de la PR, suggérant que les PNN, en tant que source d'enzymes PAD, peuvent contribuer à la génération d’auto-Ag puis d'auto-Ac qui sont essentiels pour l'apparition de la PR (Anzilotti et al., 2010; Eyles et al., 2006) ou via l’extériorisation des NET qui possèdent à leur surface des protéines citrullinées et donc seraient les auto-Ag responsables de cette production (détaillé en Chapitre C). De plus, il a été montré que les NET sont présents dans le sang périphérique, le tissu et le liquide synovial de patients PR. Les niveaux de NET dans le sérum sont plus élevés chez les patients en comparaison aux DS et il existe une corrélation positive entre la capacité des PNN à faire des NET in vitro et les taux sériques d’auto-Ac (ACPA) (Khandpur et al., 2013; Wang et al., 2018).

135 Figure 27 : Rôle des PNN dans l’articulation enflammée (Cascão et al., 2010)

BLyS : Facteur d’activation des cellules B, G-CSF : “Granulocyte colony-stimulating factor“, GM-CSF : “Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor“, IFN : Interféron, IL : Interleukine, MHC :