Quel est l'impact de la mutation NPM1 sur l'expression des lncRNAs

lncRNAs

Au vue de l'association des lncRNAs avec la mutation de NPM1, la première question a été de déterminer quel pouvait être l'impact de la présence de la mutation NPM1 sur l'expression de ces lncRNAs. Pour cela, nous avons transduit la lignée LAM HL60ER (exprimant le récepteur écotropique permettant la transduction par des retrovirus murins) avec le vecteur rétroviral XZ contenant NPM1 muté ou le vecteur vide. Le vecteur rétroviral XZ possède une séquence IRES-GFP, ce qui permet de trier les cellules GFP+ transduites. La mutation introduite dans NPM1 est la mutation

150 A présente dans la majorité des patients LAM NPM1 muté (mutation consistant en une insertion TCTG en position 956 du gène). A l'aide d'amorces spécifiques de la mutation A, nous avons pu confirmer par RT-qPCR l'expression de la forme NPM1 muté dans nos cellules transduites et triées (Figure 1A). Ces résultats ont également été validés par western blotting avec un anticorps spécifique de NPM1 mutée (fourni gracieusement par le Pr Brunangelo Falini, Pérouse, Italie) (Figure 1B). Il est important de noter que le niveau d'expression de l'ARNm NPM1 muté introduit est presque similaire à celui de NPM1 sauvage, comme observé chez les patients LAM NPM1 muté (données non montrées). On remarque aussi une légère augmentation de l'expression de NPM1 sauvage après introduction de

NPM1 muté dans cette lignée (Figure 1A).

Figure 1: Expression de NPM1 dans la lignée HL60ER transduite avec XZ-NPM1mut. A. Représentation graphique du niveau d'expression des transcrits NPM1 muté et NPM1 sauvage dans les cellules HL60ER-XZ et HL60ER-NPM1mut (triées GFP+) évalué par RT-qPCR à partir de trois transductions indépendantes; ***=p valeurs<0.001. B. Expression de la protéine NPM1 mutée évaluée par western blot avec un anticorps spécifique de NPM1 mutée. Trois transductions indépendantes, suivies d'un tri GFP+, ont été réalisées pour HL60ER-XZ et HL60ER-NPM1mut. Normalisation avec la Tubuline.

A partir de ces lignées, nous avons pu comparer le niveau d'expression de chacun des lncRNAs de la signature entre les cellules HL60-XZ et HL60-NPM1mut (Figure 2). A noter que parmi les 33 lncRNAs de la signature, seulement 22 lncRNAs sont détectables par RT-qPCR dans cette

151 lignée. La majorité des lncRNAs ne semble pas être affectée par l'introduction de la mutation NPM1 dans ce modèle. Seuls les lncRNAs XLOC_074912 et XLOC_091736 sont significativement diminués en présence de la mutation NPM1 et ces derniers étaient également sous exprimés chez les patients porteurs de la mutation NPM1 (Figure S1 "Article"). On observe aussi une sous expression des lncRNAs XLOC_028763, XLOC_028770 et XLOC_028776. Ces lncRNAs sont regroupés en cluster au niveau du bras long du chromosome 13 que nous avons appelé cluster 028, et qui sont normalement surexprimés chez les patients portant la mutation NPM1 (Figure S1 "Article").

Figure 2: Impact de la mutation NPM1 sur l'expression des lncRNAs. Expression relative de 22 sur 33 des lncRNAs de la signature NPM1 évaluée par RT-qPCR dans les HL60ER-XZ et HL60ER- NPM1mut; n=3 ; ***=p valeurs<0.001 ; **=p valeurs<0.01.

Afin de déterminer si la présence de la mutation NPM1 avait un impact sur le niveau d'expression des lncRNAs sélectionnés, nous avons utilisé une autre stratégie consistant à diminuer l'expression de la forme NPM1 mutée dans la lignée OCI-AML3 (NPM1 muté). Pour ce faire, nous avons utilisé une approche par GapmeRs. Les GapmeRs sont des petits oligonucléotides de 16nt s'hybridant spécifiquement avec un ARN cible. Cette méthode présente quelques avantages majeurs par rapport aux méthodes se basant sur l'ARN interférence. D'une part, cela fait intervenir une dégradation par la RNAse H endogène qui permet une meilleure dégradation des ARNs nucléaires. D'autre part, les GapmeRs peuvent entrer par simple diffusion passive sans agent de transfection dans les cellules, augmentant ainsi l'efficacité de transfection, et la durée de l'inhibition si le GapmeR est présent dans le milieu. Par ailleurs, l'utilisation d'une amorce plus petite qu'un siARN permet dans ce

152 cas de diminuer les hybridations partielles sur l'ARN NPM1 sauvage (4nt de différence entre NPM1 muté et sauvage). Nous avons donc transfecté transitoirement les cellules OCI AML3 avec le GapmeR ciblant NPM1 muté ou le GapmeR contrôle, et analysé les résultats à 48h, 96h et jusqu'à 6 jours post- transfection. En RT-qPCR, on observe une baisse très nette de l'ARNm de NPM1 muté (environ 75%), mais également une baisse significative de NPM1 sauvage (environ 50%) (Figure 3A). On obtient la même efficacité d'inhibition entre 48h et 6 jours (données non montrées). Ce résultat est confirmé au niveau protéique par western blotting, avec une baisse de NPM1 mutée (figure 3B).

Figure 3: Expression de NPM1 après inhibition par transfection de GapmeR dans OCI AML3. A. Niveaux d'expression de, NPM1 muté et NPM1 sauvage dans les OCI AML3 96h après transfection des GapmeRs ciblant NPM1 muté ou contrôle, évalués par RT-qPCR. n=3 ; ***=p valeurs<0.001. B. Niveau d'expression de la protéine NPM1 mutée dans les OCI AML3 des 3 expériences 96h post- transfection des GapmeRs ciblant NPM1 muté ou contrôle, par Western Blot. Normalisation avec la Tubuline.

Dans ce modèle, seule l'expression de deux lncRNAs (XLOC_080771 et XLOC_007987) varie en présence du GapmeR NPM1 muté par rapport au GapmeR contrôle (Figure 4). A noter que la diminution de l'expression de XLOC_007987 est en accord avec les résultats obtenus chez les patients (Figure S1 "Article"). A l'inverse, l'augmentation de l'expression de XLOC_080771 est contradictoire avec les résultats obtenus chez les patients (Figure S1 "Article"). Dans la lignée HL60ER, ces deux lncRNAs ne sont pas exprimés, ce qui ne permet pas de conclure. De plus, nous n'observons pas de

153 différence d'expression pour les lncRNAs dérégulés par l'introduction de NPM1 muté dans les HL60ER, suggérant une régulation spécifique de ces lncRNAs dépendante du contexte cellulaire.

Figure 4: Impact de l'inhibition de NPM1 mutée sur l'expression des lncRNAs. Expression relative de 23 sur 33 des lncRNAs de la signature NPM1 évaluée par RT-qPCR dans les OCI AML3 transfectées avec les GapmeRs NPM1 muté ou contrôle, 96h post-transfection. n=3 ; ***=p valeurs<0.001 ; **=p valeurs<0.01.

Ainsi, il apparait que la mutation de NPM1 pourrait influencer l'expression de certains des lncRNAs que nous avons observés comme étant associés à la mutation NPM1 chez les patients. Cependant, pour la majorité d'entre eux, il n'y a pas de dérégulation d'expression. L'introduction de la mutation NPM1 dans la lignée HL60ER ou la diminution de NPM1 muté dans la lignée OCI AML3 ne sont peut-être pas suffisantes pour reproduire le phénotype observé in vivo.