Excepté pour les échantillons ayant été utilisés pour le RNAseq, l’ensemble des souris ont été sacrifiées par overdose de pentobarbital sodique (180 mg/kg). Les deux hémisphères des cerveaux ont été séparés permettant d’obtenir des échantillons pour deux techniques d’analyses post-mortem différentes à partir du même animal.
Préparation des coupes
Les hémi-cerveaux ont été post-fixés pendant 24h dans une solution 4% paraformaldéhyde. Les cerveaux ont ensuite été cryo-protégés par incubation dans une solution de sucrose à 30% et des coupes coronales de 30 µm ont été réalisées au microtome. Les coupes ont été conservées dans une solution de stockage (glycogène, glycérol, PB 1M, H2Od) à -20°C avant utilisation.
Immunofluorescence
Les coupes ont été rincées dans du PBS 0.1M, 3 x 10 min. Les coupes ont ensuite été bloquées avec une solution de 4.5% NGS (Normal goat serum)/PBS 0.1M/0.2% Triton X-100 (PBST), 1h à RT. Les coupes ont été incubées sur la nuit à 4°C avec les solutions d’anticorps primaires diluées dans une solution 3% NGS/PBST (Tableau 6
)
. Les coupes ont été rincées dans du PBS 0.1M, 3x10 min etincubées avec les anticorps secondaires fluorescents appropriés (anticorps conjugués Alexa Fluor, Invitrogen) dans 3% NGS/PBST, 1h à RT. Pour le marquage STAT3α, les coupes ont été prétraitées avec une solution 100% méthanol, 10 min à -20°C, rincées et bloquées 1h dans une solution 4,5% NGS/PBS 0.1M/0.3% Triton X-100. Elles ont ensuite été incubées avec l’anticorps primaire anti- STAT3α dans la solution « Signal Stain® antibody diluent » (Cell signaling, #8112L) 72h à 4°C. Après rinçage, elles ont été incubées avec l’anticorps secondaire approprié dilué au 1/500 dans 1% BSA/PBS 0.1M/0.3% Triton X-100, 1h à RT.
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Anticorps
Références
Espèces
Dilution
IHC
IF
WB
6E10 Covance Souris 1/500
Aβ42 Life technologies Lapin 1/500
Actine Sigma Souris 1/5000
ApoE Abcam Lapin 1/1000
AT8 Thermofisher Souris 1/400
Bace1 Cell signaling Lapin 1/500 1/1000
CD14 BD Rat 1/500
GAPDH Cell signaling Lapin 1/5000
GFAP Dako Lapin 1/1000 1/5000
GFAP-Cy3 Sigma 1/1000
GFP biotinylé Vector 1/500
HT7 Innogenetics Souris 1/1000
IBA1 Wako Lapin 1/500
IDE Abcam Lapin 1/400
MBP Sigma Lapin 1/500
NeuN Chemicon Souris 1/500
P-TauS422 Abcam Lapin 1/400
PSD95 BD Souris 1/500
STAT3α Cell signaling Lapin 1/200
Synaptophysine Stressgen Souris 1/1000
Tubuline α Sigma Souris 1/1000
Tm4sf1 R&D system Mouton 1/200
Vimentine Abcam Poulet 1/1000
Tableau 6 : Liste d’anticorps utilisés et dilutions selon leurs applications.
Abréviations : IHC : immunohistochimie, IF : Immunofluorescence, WB : Western Blot
Pour le marquage MXO4 sur coupe, la solution a été diluée à 33 µg/ml (Tocris, #4920) dans du PBS 0.1M et incubée 30 min à RT. Après 3 rinçages au PBS 0.1M, les coupes ont été systématiquement incubées avec un anticorps anti-GFP biotinylé dans 3% NGS/PBST, sur la nuit à 4°C, rincées et incubées avec un anticorps Streptavidine-FITC 1/1000 (ThermoFisher Scientific, #SA100-02) dans 3% NGS/PBST, 1h à RT. Pour le marquage CD14, les coupes ont été pré-traitées avec une solution de citrate de sodium 1X, 20 min à 80°C. Après rinçage, elles ont été bloquées dans une solution 3% BSA/PBST 1h à RT. Après 3 rinçages, elles ont été incubées dans une solution 3% BSA/ PBST sur la nuit à RT, puis rincées et incubées avec l’anticorps secondaire approprié, 1h à RT. Pour le marquage Tm4sf1, les coupes ont été bloquées 1h dans une solution 5% BSA/PBST puis incubées 72h à 4°C avec l’anticorps primaire anti-Tm4sf1 dilué dans une solution 3% BSA/PBST. Après rinçage, elles ont été incubées avec l’anticorps secondaire approprié biotynilé (1/500 ; Vector, #BA-6000) dilué dans 3%
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BSA/PBST, 1h à RT. Les coupes ont été rincées puis incubées avec une solution streptavidine-Cy3(1/500 ; Sigma, #S6402) dilué dans 3% BSA/PBST, 1h à RT.
Pour finir, les coupes n’ayant pas été marquées au MXO4 ont été rincées et marquées avec du DAPI 1/2000 (Invitrogen, #D21490) dans du PBST, 10 min à RT. Elles ont ensuite été montées sur des lames SuperFrost® Plus (ThermoFisherScientifc, #J1800AMNZ) avec du milieu de montage Fluorsave™ (Calbiochem, #345789) ou Fluormount™ (Sigma, #F4680). Pour le marquage BAM10 1/1000 (Mouse, Sigma, #A3981), le kit « Mouse-On-Mouse » (Vector Laboratories, #BMK-2202) a été utilisé selon le protocole du fabriquant pour diminuer le marquage non spécifique.
Immunohistochimie
Les coupes ont été rincées dans du PSB 0.1M, 3x10 min. Pour le marquage HT7, les coupes ont d’abord été démasquées avec une solution citrate de sodium 1X, 20 min à 90°C. Les coupes ont été laissées 20 min à RT avant les rinçages pour éviter un choc thermique. Puis elles ont été traitées avec une solution d’H2O2 1/100, 20 min à RT pour inhiber les péroxydases. Elles ont ensuite été bloquées
pendant 1h à RT dans 4,5% NGS/PBST pour l’anticorps anti-Aβ42, anti-AT8 et anti-HT7 ou dans 3% BSA/PBST pour l’anticorps P-TauS422. Les coupes ont été incubées sur la nuit ou 48h à 4°C avec les anticorps primaires dilués dans 3% NGS/PBST (Tableau 6
)
. Les coupes ont été rincées et incubéesavec l’anticorps secondaires biotinylés appropriés (Vector Laboratories) dans 3% NGS/PBST, 1h à RT, rincées et incubées avec le complexe avidine/biotine, 1/250 chacun dans du PBST, 1h à RT. Pour finir, après avoir été rincées, les coupes ont été révélées en utilisant une solution de VIP (Vector Laboratories, #SK-4600), montées sur des lames SuperFrost® Plus et séchées sur la nuit à RT. Enfin, les coupes ont été déshydratées comme suivant : 2x1 min dans un bain d’acétone, 2x3 min dans un bain de xylène et montées avec du milieu de montage Eukitt (Chem-Lab, #UN1307).
Microscopie et quantification des immunomarquages
Mesure de volumes, d’intensité de marquage et comptage des plaques amyloïdes.
Les coupes marquées avec l’anticorps anti-CD14 ont été acquises avec un Axio scanZ.1 (Zeiss), avec un grossissement x40. Un seuillage a été appliqué et le pourcentage d’aire CD14+ a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ. Les coupes marquées avec l’anticorps anti-Aβ42 ont été acquises avec l’Axio scanZ.1 (Zeiss), avec un grossissement x10. Un seuillage a été appliqué et une sélection semi- automatique des plaques de l’hippocampe a été effectuée sur le logiciel Morphostrider. Pour les marquages GFAP, BAM10, MXO4, AT8, HT7 et P-TauS422, des reconstructions en mosaïques ont été acquises avec un microscope à épifluorescence (Leica, BM6000B) au 10x. Le niveau de gris moyen du marquage GFAP a été automatiquement mesurée grâce au logiciel ImageJ dans la zone infectée (GFP+), manuellement délimitée sur 10 coupes environ par animal (espace inter-coupes de 240 µm).
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Le bruit de fond a été mesuré dans une zone hors marquage et soustrait. Le nombre de plaquesBAM10+ et MXO4+ ainsi que l’aire AT8+ et P-TauS422+ ont été mesurées de façon semi-automatique à l’aide d’un seuillage dans l’hippocampe entier, manuellement délimité, avec le logiciel ImageJ. L’aire HT7+ a été manuellement délimitée dans l’hippocampe.
Des images de l’hippocampe (3 images/coupes sur 3 coupes/souris) ont été acquises par microscopie confocale (Leica TCS SPE) à l’objectif 40X avec un pas de 1 µm et un zoom de 1,5. Pour le marquage STAT3α, les corps cellulaires ont été manuellement délimités et l’intensité du marquage mesuré. Le niveau de gris moyen du marquage MAP2 a été mesuré sur l’intégralité de l’image. L’épaisseur de la couche CA1 a été manuellement mesurée à partir du marquage NeuN.
Comptages cellulaires
Des images de l’hippocampe (3 images/coupes sur 3 coupes/souris) ont été acquises par microscopie confocale (Leica TCS SPE) à l’objectif 40X avec un pas de 1 µm et un zoom de 1,5. Pour les marquages Vimentine et Tm4sf1, les cellules ont été manuellement comptées en utilisant le logiciel Image J.
Mesure de l’accumulation de l’Aβ dans les cellules microgliales.
Pour la quantification de la recapture de l’Aβ par la microglie, des images confocales ont été acquises au 63x, zoom 2. L’intégralité de la plaque a été acquise avec un pas de 0,4 µm. Les cellules IBA1+ ont été classées manuellement en 3 catégories : MXO4+ au niveau de la membrane, MXO4+ dans le soma et MXO4-. La présence de MXO4 dans la cellule a été vérifiée grâce à des projections orthogonales. L’ensemble des cellules IBA1+ a été, par la même occasion, compté pour mesurer leur accumulation autout des plaques amyloïdes.