Images de cellules

Le contraste et la luminosité de toutes les images fournies par le capteur sont modifiés pour accentuer la lisibilité. Le capteur enregistre sur l’ensemble de la surface sensible soit 2,8 x 3,7 mm qui correspond aux 640 x 480 pixels de l’image.

Figure 61- Image fournie par le capteur de RPE1 sur une lamelle de verre de 175 µm De gauche à droite, série de zooms numériques.

Environ 600 cellules sont visibles sur l’image complète (Figure 61). Les cellules sont à faible confluence. Un zoom numérique permet de visualiser quelques cellules. La morphologie allongée caractéristique des RPE1 est clairement observée. Pour plus de lisibilité, les résultats suivants sont montrés sur des images où un zoom numérique a été réalisé.

Figure 62- Zoom numérique d’images par le capteur de RPE1 (le carré fait 800 µm de côté) avec une lamelle de :

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La variation d’épaisseur des lamelles a un effet sur la visualisation des RPE1 sur l’image. Une impression de grandissement se dégage le long de la gamme des épaisseurs : de 50 µm, où les cellules apparaissent très petites, jusqu’à 1 mm où elles apparaissent plus grosses et floues. L’observation visuelle est satisfaisante entre 100 et 300 µm : les cellules sont clairement reconnaissables et le contraste est agréable. Les lamelles de 175 µm étant faciles à manipuler, pour la suite cette épaisseur a été considérée comme un optimum (Figure 62).

Morphologie cellulaire

Différentes lignées cellulaires ont été testées pour vérifier que notre système permet de bien distinguer des morphologies cellulaires différentes, et si l’optimum observé pour les RPE1 était différent selon les lignées cellulaires.

Le tableau suivant réunit les différentes lignées testées :

Nom Type cellulaire Motif d'utilisation

RPE1 Cellules humaines épithéliales

de rétine d'œil

Lignée adhérant bien et s'étalant beaucoup. Cellules les plus "grandes" du laboratoire

HeLa Fibroblastes humains

issues d'un adénocarcinome

Lignée classique pour valider un

microsystème pour les cellules

16HBE Cellules humaines épithéliales

de bronches

Lignée dont les cellules se regroupent en "alvéoles", pour tester si le microsystème peut distinguer les cellules dans une même alvéole

Le même effet a été observé avec toutes les lignées : les cellules apparaissent peu visibles à de faibles épaisseur de lamelles, puis contrastées pour des épaisseurs de 150 à 300 µm et enfin floues au-delà de 500 µm. Nous avons ainsi validé un optimum de visualisation et de manipulation pour une épaisseur de 175 µm.

Pour compléter l’étude de morphologie, les C2C12, lignée de myoblastes de souris qui peuvent se différencier en culture en myotubes, ont également été observées (uniquement avec cet optimum de 175 µm d’épaisseur). La différenciation nécessitant des cellules à confluence, nous avons souhaité vérifier si nous pouvions distinguer des cellules individuelles dans un tapis cellulaire à confluence avant d’observer dans le temps une différentiation.

Sur les images de différentes lignées cellulaires fournies par le capteur, la morphologie caractéristique apparaît clairement (Figure 63) :

• les formes légèrement triangulaires des HeLa,

• les cellules en « alvéoles » des 16HBE,

• les cellules peuvent être distinguées dans le tapis de C2C12 à confluence.

Notre microsystème permet donc de distinguer des morphologies cellulaires différentes. En revanche, sur toutes ces images aucune organelle, telle que le noyau, n’est observée.

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Figure 63- Zooms numériques d’images fournies par le capteur de différentes lignées cellulaires sur des lamelles de verre de 175 µm d’épaisseur.

Comparaison avec la microscopie classique à l’optimum

Pour vérifier les performances de notre système, nous avons comparé nos images de cellules adhérentes à celles de microscopes classiques en lumière blanche. Deux types de comparaisons peuvent être réalisés : « technique » ou « fonctionnelle ».

Les images obtenues ressemblent à des images formées par un microscope à transmission (microscope à contraste de phase, dont le diaphragme annulaire a été supprimé). L’image se forme ainsi, au premier abord, de façon similaire à celle d’une microscopie par transmission, ce qui permet de réaliser une comparaison « technique » entre les deux systèmes d’imagerie (Figure 64). La morphologie des cellules est observée par les deux outils d’imagerie.

Figure 64 – Comparaison « technique » d’images de 16HBE sur une lamelle de 175 µm d’épaisseur.

Le contraste et la luminosité des deux images ont été fortement modifiés pour l’impression. Ces paramètres sont donc peu comparables. Il est à noter que l’image par transmission varie fortement en fonction du positionnement en z de l’échantillon cellulaire par rapport à

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l’objectif du microscope. L’image de la Figure 64 a donc été choisie pour sa ressemblance avec l’image de notre système.

Notre microdispositif image des cellules adhérentes sans marquage. Or, cette fonction est classiquement réalisée avec un microscope à contraste de phase.

Figure 65- Comparaison « fonctionnelle » d’images de RPE1 sur une lamelle de 175 µm d’épaisseur.

Les informations de morphologie et de positionnement fournies par notre système sont similaires à celles fournies par un microscope à contraste de phase (Figure 65) : la forme allongée et la disposition des cellules dans la population sont semblables. Néanmoins, le contraste de l’image par microscopie à contraste de phase, est bien meilleur : les cellules apparaissent noires entourées d’un halo blanc, alors que sur l’image fournie par notre microsystème, elles apparaissent blanches avec un léger contour blanc.

Par ailleurs, le microscope par transmission ou le microscope à contraste de phase permettent d’imager un nombre de cellules inférieur à notre microsystème. Pour pouvoir comparer toute la zone imagée par notre dispositif, il est nécessaire de réaliser plusieurs images avec le microscope. La surface observée est plus importante avec notre dispositif. En revanche, la résolution (i.e. le nombre de points pour définir un contour cellulaire) est clairement plus petit avec notre dispositif qu’avec l’objectif 4X d’un microscope.

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Un prototype de visualisation de cellules adhérentes par imagerie de contact a été conçu et assemblé. Le capteur a été conditionné pour supporter les liquides à l’aide de matériaux suffisamment biocompatibles pour les cellules utilisées. Les cellules ont été visualisées et l’effet de la distance objet/surface sensible a été étudié expérimentalement. Les cellules apparaissent sur les images peu visibles à de faibles épaisseurs de lamelle, puis contrastées sur des épaisseurs de 150 à 300 µm et enfin floues au-delà de 500 µm. L’augmentation de la distance entre les cellules et le capteur donne une impression de grandissement et de dégradation de la « netteté ». Un optimum pour l’observation visuelle a été trouvé pour une lamelle de verre d’épaisseur 175 µm. La morphologie des cellules est similaire à celle attendue et visualisée par un microscope.

Dans le prochain chapitre, nous souhaitons confirmer de façon plus théorique ces observations. Pour cela, nous cherchons à mieux comprendre le mécanisme de formation de l’image.

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4 Appréhension

du mécanisme de formation d’image

L’objectif de ce chapitre est de comprendre le mécanisme de formation de l’image par notre microsystème d’imagerie de contact.

Au préalable, il a été nécessaire de bien caractériser les différents éléments du système optique :

* la microstructure du capteur,

* la forme et les indices de la lamelle, des cellules, et du milieu de culture dans la chambre * l’éclairage de la LED.

A l’aide de ces données et d’une bonne connaissance des images fournies par le capteur, il est ensuite possible de s’inscrire dans un cadre théorique pour proposer un mode de formation de l’image par le microsystème.

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