Ce paragraphe essaie de quantifier les éléments appréciés lors de la validation d’une épaisseur optimale de lamelle. Pour cela, l’influence de la lamelle de verre dans les images de RPE1 et des images de réseaux de Ronchi obtenues par le microsystème, est analysée.
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4.2.1 Analyse des images de RPE1
Une série d’images de RPE1 réalisée par le microsystème a été analysée de façon plus approfondie.
Si on zoome numériquement sur une cellule, les pixels apparaissent. Il est difficile de délimiter exactement une cellule. Par exemple sur la Figure 78, les limites de la zone brillante sont délimitées à l’aide d’un trait continu et celles de la zone sombre entourant la cellule à l’aide d’un trait en pointillés. La petite zone comprend 33 pixels soit a priori 1000 µm2, ce qui est cohérent avec la taille. La zone la plus large englobant la zone sombre comprend 78 pixels soit près de 2400 µm2.
Figure 78- Zoom numérique sur une cellule RPE1 d’une image réalisée par le microsystème avec une lamelle de 175 µm d’épaisseur. Une couleur par niveau de gris a été fixé. La cellule a été entourée
d’un trait plein et d’un trait en pointillés. Un carré fait a priori 5,6 µm de côté.
Pour mieux visualiser cet effet clair/sombre, des profils en intensité le long de cellules ont été réalisés (Figure 79).
La zone sombre est visualisée par 2 pics d’intensité plus faible que la moyenne de l’image et la zone claire par un pic d’intensité supérieure à la moyenne de l’image. Le profil s’étale sur une dizaine de pixels.
Ces coupes en intensité ont été réalisées pour différentes épaisseurs de lamelle de verre. Comme les courbes possèdent une allure similaire, la moyenne des profils sera considérée pour une épaisseur. Les moyennes des profils pour les différentes épaisseurs de lamelle de verre ont été superposées. Pour plus de lisibilité, une seule courbe par épaisseur est montrée dans la Figure 80.
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Figure 79- Image de cellules RPE1 sur une lamelle de 175 µm d’épaisseur (à gauche) ;
Profils en intensité de 5 cellules (à droite en haut) mesurés selon la ligne correspondante dans l’image et courbe de la moyenne de ceux-ci (à droite en bas).
Figure 80- Superposition des moyennes des profils de cellules réalisés pour différentes épaisseurs de lamelle de verre.
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Quelle que soit l’épaisseur de la lamelle de verre, les profils observés sont similaires, c’est-à- dire ils comportent deux pics « sombres » et un pic « clair » et s’étalent sur une dizaine de pixels. Il n’y donc pas a priori d’influence de l’épaisseur de la lamelle de verre sur la taille de l’image de la cellule obtenue par le capteur. L’impression de grandissement signalé au chapitre précédent n’est donc pas confirmée par les mesures.
4.2.2 Observation de réseaux de Ronchi
Pour vérifier cette constatation, nous avons choisi d’imager des objets de taille connue. Deux types d’objets peuvent être envisagés : des microbilles de polystyrène ou bien des réseaux de Ronchi.
Les expériences réalisées avec les microbilles n’ont pas été concluantes. En effet, pour être sûr que les billes soient à la surface de la lamelle, nous avons décidé d’évaporer le liquide dans lequel ces petites particules sont vendues. Or, lors de cette évaporation elles se sont agrégées spontanément. Il était alors difficile de savoir si les taches observées par le capteur correspondaient à une ou à plusieurs billes.
Les réseaux de Ronchi sont des trames alternant des lignes opaques et des lignes transparentes de même largeur. Un réseau est caractérisé par le nombre de paires de ligne par mm ou LP/mm (une opaque / une transparente). Des réseaux ont été achetés chez Edmund Optics et découpés de la même façon que les lamelles de verre. Pour tester des conditions similaires aux expériences avec les cellules :
• une lamelle de verre d’épaisseur connue a été introduite entre le réseau et le capteur • le milieu interstitiel a pu être du milieu de culture
Les différentes conditions testées sont résumées par la Figure 81 :
Figure 81- Schéma des expériences avec les réseaux de Ronchi.
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Figure 82- Image de réseau de Ronchi et profil observé pour 10 LP/mm (en haut) et pour 50 LP/mm (en bas) sur une lamelle de verre de 70 µm d’épaisseur dans l’air.
La fréquence du profil est déterminée pour les différentes conditions (épaisseur de lamelle de verre, nature du milieu interstitiel) :
• Le réseau de 10 LP/mm est bien imagé par le capteur. Le crénelage est observable sur
le profil d’intensité. La période est de 18 pixels (100,8 µm) et est constante selon toutes les conditions.
• En revanche, le profil de l’image du réseau 50 LP/mm est triangulaire. L’image est donc peu résolue. La période observée est de 3,6 pixels (20,2 µm). Le nombre n’est pas entier, car une paire opaque/transparente n’est pas observée sur un nombre constant de pixels. Cette fréquence varie également peu en fonction des conditions examinées dans l’expérience.
• Pour 100 LP/mm, le crénelage n’est pas discernable du bruit de fond. Le capteur ne permet donc pas d’imager de tels détails.
Deux informations importantes peuvent être déduites de ces observations : -l’épaisseur de la lamelle de verre n’influe pas sur la taille de l’image d’un objet -la résolution du capteur est supérieure à 5 µm et proche de 10 µm.
Une troisième information peut être obtenue de ces expériences. Ce n’est pas la fréquence de l’objet qui varie avec l’épaisseur de la lamelle de verre, mais son contraste. Cela est frappant, si l’on prend une grande différence d’épaisseur de la lamelle de verre (Figure 83).
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Figure 83- Image du réseau de Ronchi pour 10 LP/mm dans l’air sur une lamelle de verre d’épaisseur 175 µm (à gauche) et 1675 µm (à droite).
Sur l’image avec une épaisseur de 175 µm, la zone transparente est très blanche et la zone opaque est très noire, alors que sur l’image avec une épaisseur de 1675 µm, la zone transparente est gris clair et la zone opaque est gris foncé. La distance sur laquelle le contraste est suffisant étant importante, cela signifie que la source est peu divergente. Cette divergence a été confirmée par les mesures de caractérisations de la LED (divergence de 18°). En regardant les images de cellules, la même constatation peut être facilement réalisée (Figure 62).
4.2.3 Résolution du microsystème
Comme observé avec le réseau 50 LP/mm, il existe une limite de résolution liée à l’échantillonnage. Le théorème de Shannon énonce que la fréquence d'échantillonnage d'un signal doit être égale ou supérieure au double de la fréquence maximale contenue dans ce signal pour être correctement échantillonné.
La fréquence d’échantillonnage de notre système est de 1/5,6 µm= 0,18 µm-1. La fréquence spatiale maximum que le système échantillonne correctement est donc de 0,089 µm-1 ou un pas de 11,2 µm. Au sens de Shannon, l’objet « cellule » de taille caractéristique 25 µm est donc correctement échantillonné, par contre les détails intracellulaires de l’ordre du micron ne le sont clairement pas.
Il s’agit d’une limite intrinsèque à notre système optique.