“ Active multilayered capsules as a new strategy for in vivo bone formation ”
FACCA S, CORTEZ C, MENDOZA-PALOMARESC, MESSADEQN, DIERICHA,
JOHNSTONAPR, MAINARD D, VOEGELJC, CARUSOF, BENKIRANE-JESSELN.
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II.1 Résumé du travail
Objectifs
Il avait été préalablement démontré que des facteurs de croissance (BMP-2 et TGF-β1)
incorporés dans un film de multicouches de polyélectrolytes plan pouvaient induire in vitro, la
différenciation de cellules souches en cellules osseuses ou cartilagineuses (Dierich et al,
2007). Cette stratégie intéressante, nécessite néanmoins pour une utilisation in vivo, une implantation du substrat, sur lequel nous avons construit le film de multicouches et incorporé des facteurs de croissance. Afin de s’affranchir de ce facteur limitant, une autre stratégie consiste à utiliser des capsules de multicouches sphériques (Caruso et al, 1998). Ces capsules de multicouches sphériques sont alors injectables ou incorporables dans un gel biodégradable
pour faciliter leur implantation. Il était donc intéressant, d’une part de voir in vitro l’effet de
ces facteurs de croissance incorporés dans des capsules de multicouches de polyélectrolytes
sur des cellules souches embryonnaires, et d’autre part de tester l’activité de ces capsules in
vivo par une implantation ectopiques sur des souris, en utilisant un gel d’alginate comme matrice extra-cellulaire. A terme, notre objectif sera de fonctionnaliser un biomatériau capable d’activer la réparation osseuse altérée localement sur le squelette osseux.
Méthodes
Comme biomatériau, nous avons choisi un système sphérique de type capsule construit sur le
modèle couche par couche : avec de l’acide poly-ℓ-glutamique (PℓGA) et du poly-ℓ-lysine
(PℓL) en y incorporant deux facteurs de croissance : à la fois de la BMP-2 et du TGF-β1. Ces
particules nanostructurées et fonctionnalisées avec des facteurs de croissance pouvant induire une différenciation en lignée osseuse des cellules souches embryonnaires, ont été testés sur des corps embryoïdes (EB), puis ont été implantées en sous-cutané sur des souris « nude ». Après explantation, les capsules et leur tissu périphérique ont été analysés par histologie, immunofluorescence et en microscopie électronique.
99 Résultats principaux
Afin de vérifier la bonne construction des capsules, nous avons analysé en microscopie confocale, la formation du film de multicouches de polyélectrolytes autour des capsules. Ces capsules ayant 2 épaisseurs différentes (3 µm et 1 µm) ont été formées en utilisant des noyaux de silice de taille différente, qui ont été secondairement dissous. L’enveloppe externe des
capsules formées comprend bien les couches de PℓL et PℓGA et les protéines BMP-2 et
TGF-β1 à l’intérieur du film. La comparaison entre les capsules fonctionnalisées par BMP-2 et
TGF-β1 et les capsules sans facteurs de croissance montre clairement que sans facteurs de
croissance, les capsules nanostructurées sont plus fines, ce qui démontre encore une fois une bonne incorporation de nos 2 facteurs de croissance.
In vitro, nos résultats histologiques indiquent, que les capsules ainsi fonctionnalisées par
BMP-2 et TGF-β1 procurent bien un environnement favorable à la différenciation
ostéogénique des cellules souches dérivées des EB. Nous avons bien pu visualiser : en microscopie électronique les ostéoblastes, ostéocytes, ostéoclates présentant les caractéristiques classiques, ainsi qu’une biominéralisation à 21 jours de culture en présence
des particules multicouches de (PℓL-PℓGA)5-PℓL-BMP2-PℓL-TGFβ1-PℓL.
In vivo, l’analyse histologique les capsules fonctionnalisées par BMP-2 et TGF-β1 implantées
dans du gel d’alginate sont capables d’induire une différenciation ostéogénique des cellules souches dérivées des EB. Le gel d’alginate ajouté lors de l’implantation est nécessaire, car il représente une « gel » matrice. La différenciation des ostéoblastes au sein d’un tissu osseux minéralisé est aussi visualisé après coloration au Von Kossa au bout de 21 jours de culture sur
les ostéoprogéniteurs en présence des particules multicouches de (PℓL-PℓGA)5-Pℓ
L-BMP2-PℓL-TGFβ1-PℓL. En terme de contrôle, nous avons démontré que les capsules non
fonctionnalisées n’induisent pas de formation osseuse. Conclusions du travail
Nos résultats prouvent que nous sommes capables d’induire in vitro tout comme in vivo, la
néoformation de tissu osseux minéralisé par les cellules souches embryonnaires, via ces capsules de multicouches nanostructurées incorporant deux facteurs de croissance osseux. Mots clés : capsules, BMP-2 , TGFβ1, corps embryoïdes, ostéoblastes, induction osseuse
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II.2 Article
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II.3 Résultats et discussion
En chirurgie traumatologique, les défects osseux (ou comminution) localisés sont un problème au quotidien. Ils peuvent être d’origine tumorale (Liverneaux, 2003), ostéoporotique (sujets âgés) ou post-tramatiques (fractures) (Liverneaux, 2004). Il existe certes des méthodes de comblements osseux (SOFROT, 2011), mais il faut attendre le processus naturel de colonnisation du subsitut osseux, puis de minéralisation des ostéoblastes. L’apport de l’ingénierie tissulaire s’avère donc intéressant, afin de résoudre localement un défaut de régénération osseuse. Dans cette étude nous avons voulu développer un biomatériau à la fois capable d’induire du tissu osseux et d’être injecté par voie « mini-invasive » du fait de la taille de la capsule. Nos résultats suggèrent que la différenciation en lignée osseuse des cellules souches embryonnaires (EB) est possible en présence de nos capsules de multicouches de polyélectrolytes fonctionnalisées avec deux facteurs de croissance osseux.
La bonne construction des films de multicouches sous forme de capsules (autour d’une particule de noyau de silice) a été possible. Ensuite l’incorporation des facteurs de croissance entre 2 polyélectrolytes au sein du film de multicouches s’est avérée satisfaisante comme le laissait présager d’autres études avec incorporation de protéines dans les multicouches
(Benkirane-Jessel et al, 2003) (Benkirane-Jessel et al, 2004). Les constructions de
l’enveloppe externe des capsules ont été vérifiées et caractérisées avec succès par 2 méthodes : la technique de double polarisation interférométrique (DPI) et la visualisation des capsules par microscopie confocale. Après une construction physicochimique concluante, restait à savoir si ces capsules et si les facteurs de croissance incorporés, allaient avoir une activité biologique d’ostéoinduction. Pour le prouver, nous avons utilisé des corps
embryonnaires (Loubet et al, 1998) mis au contact des capsules in vitro, puis in vivo et
regardé s’il y avait induction de la formation osseuse.
Dans un premier temps, l’activité biologique des capsules fonctionnalisées a été testée
in vitro sur des cellules souches embryonnaires. Les résultats sont satisfaisants, puisqu’une
ostéoinduction est constatée. Une différenciation en lignée osseuse et une biominéralisation
sont apparues. Tandis que dans le groupe témoin (capsules sans BMP-2 et TGF-β1) aucune
différenciation ou minéralisation n’a eu lieu, confortant bien l’hypothèse que se sont les facteurs de croissance osseux, qui sont responsables de l’action d’ostéoinduction sur les
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cellules souches et qu’ils sont restés actifs in vitro, malgré l’incorporation dans le film. Les
cellules souches se différencient sous l’influence du milieu de culture (Zur Nieden et al,
2003) (Trojani et al, 2008). BMP-2 et TGF-β1 incorporés dans le film de multicouches
induisent non seulement la différenciation cellulaire mais aussi l’expression de l’ostéopontine, la synthèse de collagène de type I et de cristaux d’hydroxyapatite, marqueurs d’une minéralisation correcte de la MEC et signe que les ostéoblastes obtenus sont actifs.
Dans un second temps, l’activité biologique des capsules fonctionnalisées a été testée in vivo, avec des cellules souches embryonnaires implantées dans du gel en position sous-cutanée sur des souris « nude ». Les résultats là aussi sont satisfaisants avec visualisation d’une différenciation en ostéoblastes et une biominéralisation de la MEC. Un second groupe
témoin (capsules avec BMP-2 et TGF-β1 mais implantées sans gel d’alginate) a été testé en
parallèle. Il n’a été constaté aucune différenciation ou minéralisation des capsules fonctionnalisées dans ce groupe d’implantation sans gel. Nous avons aussi utilisé les propriétés du gel d’alginate comme matrice pour faciliter l’implantation et l’intégration des cellules. De plus, le gel d’alginate s’avère nécessaire comme matrice extra-cellualire.
L’incorporation des facteurs BMP-2 et TGF-β1 au sein du film de multicouches n’altère pas
leur action biologique d’ostéoinduction sur les cellules souches embryonnaires. Les facteurs restent actifs in vivo au sein de la multicouche de polyélectrolytes.
Au cours de l’expérimentation in vitro, nous avons pu induire temporairement des
cellules de la lignée chondrocytaire autour du dixième jour de culture des EB en présence de nos capsules actives. Nous pouvons ainsi tenter de stopper cette différenciation à ce stade, à des fins de régénération du tissu cartilagineux ou de la région ostéochondrale. Dans ce cas et afin de stabiliser l’induction chondrogénique spécifique du cartilage, on peut envisager l’incorporation des siRNA ostéopontine et ostéocalcine, pour bloquer la minéralisation
(Zhang et al, 2010). Nos deux expérimentations se sont portées vers la régénération osseuse
pure : mais pourquoi ne pas appliquer la technique à la rénégération cartilagineuse voire à une régénération mixte ostéoarticulaire, en bloquant certaines capsules au stade chondrocytaire et en laissant certaines capsules évoluer vers la lignée ostéoblastique ?
Plusieurs limites semblent exister dans cette étude et peuvent être discutées afin de poursuivre l’expérimentation. Nous avons utilisé des cellules souches embryonnaires : pourquoi ne pas utiliser des cellules souches mésenchymateuses ou des cellules
108 osseuses primaires directement ? Les problèmes de greffes spongieuses autologues sont bien
connus (Trojani et al, 2008), entre la morbidité du prélèvement et la qualité de l’os prélevé
atteint de la même maladie osseuse. Les cellules souches apparaissent donc comme une source d’os de meilleure qualité. Au lieu des cellules embryonnaires (non utilisables chez l’homme à l’heure actuelle pour des raisons éthiques), on pourrait envisager d’utiliser les cellules souches mésenchymateuses autologues adultes, obtenues soit à partir des adipocytes
après liposuccion, soit de la moelle osseuse ou du plasma après centrifugation (Saw et al,
2011). Et on vérifierait l’effet de nos nanostructures in vitro puis in vivo selon le même
protocole décrit. Il est clair qu’on ne peut en aucun cas extrapoler l’effet produit sur les cellules souches embryonnaires par nos capsules, à l’effet qui serait constaté sur les cellules souches mésenchymateuses autologues, n’oublions pas que dans le premier cas, elles sont
totipotentes (Loubet et al, 1998), alors que dans le second cas elles sont multipotentes
(Doetschmann et al, 1985) (Resnik et al, 1992).
Les résultats de cette seconde étude démontrent que nous sommes en mesure de proposer un biomatériau facile à produire, facile à injecter, biodégradable, bifonctionnalisé,
ostéoinducteur in vitro comme in vivo. D’autres travaux avaient été réalisés avec des
microgranules composites à partir de collagène et chitosane avec incorporation de TGF-β1
(Lee et al, 2006). Ces travaux avait aussi permis une régénération osseuse in vitro puis in
vivo. La particularité de notre travail réside dans l’utilisation de capsules bifonctionnalisées et injectables, qui peuvent être utilisées localement dans le cas de défect osseux pour une régénération tissulaire ciblée et localisée.
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