CHAPITRE I : Formation et identité cellulaire du cortex
III. Le cortex dans les racines latérales : présence d’outer-cortex et absence d’inner-cortex
III.2 Identification des tissus internes dans les différents types de racines latérales
Parmi les 8 anticorps identifiés à la suite du criblage, nous n’en avons retenu que trois dans la suite des analyses. Nous avons ainsi choisi les trois anticorps donnant des profils complémentaires permettant de distinguer les différents types de cortex et qui présentaient les profils les plus spécifiques. Les immunolocalisations des racines latérales ont été réalisées avec les anticorps M 14 (marquage de toutes les couches de cortex), M 133 et M 107 (marquage de l’outer-cortex et du sclérenchyme) (Figure 8 et Annexe 2). Les anticorps M 107 et M 133 marquent toutes les couches entre l’endoderme et l’exoderme pour les trois types de racines latérales, signifiant donc que ces couches sont soit de l’outer-cortex soit du sclérenchyme. Ces couches sont identifiées grâce au marquage du M 14, qui marque exclusivement les cellules corticales. En effet, le double marquage M 14 avec le M 107 ou le M 133 permet d’identifier ces cellules comme du cortex, et plus précisément comme de l’outer-cortex. Ces résultats permettent donc de conclure quant à la nature de la couche jusqu’ici non identifiée des SLR comme une couche d’identité corticale, et également d’avancer qu’aucune racine latérale ne présente d’inner-cortex. Nous avons confirmé la présence d’une couche de sclérenchyme dans les L-LLR et son absence dans les T-LLR et SLR par coloration FASGA et par immunolocalisation avec l’anticorps M 150 spécifique du sclérenchyme. La coloration FASGA est un marqueur histochimique spécifique des tissus
52 Figure 8: Identification des tissus internes des SLR, T-LLR et L-LLR.
Les immunolocalisations ont été réalisées sur des racines latérales prélevées sur des plantules cultivées 4 semaines en hydroponie. Les images sont réalisées à l’aide d’un microscope confocal et montrent la superposition d’une photo prise à 561 nm correspondant à la longueur d’onde du fluorochrome couplé à l’anticorps secondaire, et d’une photo prise sous UV permettant de visualiser l’autofluorescence de toutes les parois des cellulaires. Chacun des trois anticorps M 14, M 107 et M 133 a été hybridé sur les trois types racinaires. Barres=20µm
Abréviations : Large- Large Lateral Roots (L-LLR), Thin- Large Lateral Roots (T-LLR), Small Lateral Roots (SLR), couche d’endoderme (ed), cortex (c), sclérenchyme (sc), exoderme (ex) et épiderme (ep).
53 lignifiés (Tolivia and Tolivia 1987), et permet ainsi la distinction du sclérenchyme et des faisceaux vasculaires par rapports aux autres tissus racinaires (Figure 9).
54 Figure 9: Présence ou absence de la couche de sclérenchyme dans les SLR, T-LLR et L-LLR par coloration FASGA et immunolocalisation du marqueur M150.
Pour chaque type de LR sont présentées une image de coupe radiale en autofluorescence (sous lumière UV), une coupe radiale colorée au FASGA (observée en lumière blanche) et une coupe radiale sur laquelle une immunolocalisation avec le M 150 a été réalisée. Ces images sont réalisées à l’aide d’un microscope confocal et montrent la superposition d’une photo prise à 561 nm correspondant à la longueur d’onde du fluorochrome couplé à l’anticorps secondaire, et d’une photo prise sous UV permettant de visualiser l’autofluorescence de toutes les parois des cellulaires. Barres=20µm
(a) (b) (c) L-LLR T-LLR SLR FASGA M 150
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Conclusion
Les marqueurs d’identité développés dans le cadre de cette étude ont permis de préciser l’organisation interne des racines séminales et de distinguer deux types de cortex dans ces racines: l’inner et l’outer-cortex. Ces marqueurs ont également permis de définir l’organisation tissulaire des racines latérales du riz (Figure 10), avec un marquage plus précis que les colorations histochimiques. Aucune de ces racines ne possèdent d’inner-cortex, ce qui est assez surprenant pour les L-LLR, qui semblent avoir une organisation très proche de racines séminales. Cependant leur diamètre est moins important, ce qui confirme bien l’existence d’une corrélation entre le nombre de couches de cortex et le diamètre racinaire. Cette étude a également permis d’identifier la couche centrale des SLR comme de l’outer-cortex. Cette couche avait auparavant été décrite comme du sclérenchyme à plusieurs reprises (Lux, Luxova et al. 2004; Rebouillat, Dievart et al. 2009), ou comme du cortex par une étude japonaise (Kono, Igeta et al. 1972). Les anticorps pariétaux se présentent donc comme un nouvel outil, rapide et facile d’usage, pour l’analyse des anatomies racinaires. Ils pourront être utilisés dans le but d’identifier et de différencier les tissus corticaux dans des mutants racinaires (cf. Chapitre 2. I.1.2). De plus, les composants des parois cellulaires étant communs à toutes les cellules végétales (Rose 2003), le protocole de criblage des anticorps pariétaux pourrait être transposé à d’autres organes ou d’autres espèces afin d’identifier d’autres marqueurs tissu-spécifiques.
La couche d’inner-cortex décrite dans cette étude avait déjà été caractérisée chez une espèce de riz sauvage (Yang, Zhang et al. 2014) comme la couche de cortex la plus interne et plus lignifiée. Ce terme est également retrouvé dans la description de tissus subcorticaux chez le maïs (Baluška 1995) où il désigne la couche de cortex formant des aérenchymes. Dans cette même étude le terme outer-cortex désigne la couche de cortex lignifiée ayant un rôle de soutien, qui correspondrait à la couche de sclérenchyme chez le riz. Chez A.thaliana cette couche est appelée middle-cortex. Ces données mettent en avant la nécessité de définir les termes utilisés pour décrire les tissus internes, qui ne sont, à ce jour régis par aucune règle. Nous avons proposé d’utiliser les termes d’inner et d’outer-cortex pour les deux types de cortex présents dans les racines de riz, en raison de leurs positions anatomiques respectives (Henry, Divol et al. 2016). La formation de la couche de « middle-cortex » d’A.thaliana est bien décrite dans la littérature. Elle serait formée à partir d’une division tardive d’une cellule d’endoderme (Baum, Dubrovsky et al. 2002; Paquette and Benfey 2005). L’existence de ce tissu chez deux espèces distantes de 150 Ma sur le plan évolutif pose la question de son rôle dans la physiologie et le développement racinaire. Des études récentes ont apporté des précisions sur sa fonction, sa formation et la régulation de sa mise en place chez A.thaliana. Cette couche de cortex tardive serait impliquée dans la tolérance à divers stress abiotiques (Cui 2015), et sa mise en place dépendrait de l’activité de plusieurs gènes déjà connu pour leur implications dans la mise en place des tissus internes comme SHR et SCR (Koizumi, Hayashi et al. 2012). Nous connaissons l’existence de gènes orthologues chez le riz, appelés OsSHR1&2 et OsSCR1&2. Cependant aucune information
56 Figure 10: Schéma des anatomies racinaires des LR
57 relative à leur implication dans la mise en place de ce tissu n’est disponible à l’heure actuelle. Nous avons donc décidé de remédier à ce problème en tentant d’identifier la fonction des gènes OsSHR1 et OsSHR2 dans la formation du cortex.
L’origine de la première cellule d’inner-cortex est encore peu claire. Il est actuellement impossible de trancher entre les deux hypothèses concernant sa formation : S’agit-il d’une division de cellule d’endoderme ou bien d’une division d’une cellule initiale ? Un travail est en cours au laboratoire pour définir l’origine de cette couche, avec notamment un projet de modélisation de la mise en place des tissus racinaires en collaboration avec l’équipe Virtual Plant dirigée par Christophe Godin (INRIA, Montpellier). La suite de notre étude concerne le contrôle moléculaire de la mise en place des couches de cortex chez le riz, en analysant la fonction des gènes OsSHR1 et OsSHR2 orthologues au gène AtSHR d’A.thaliana, dans la formation du cortex et des autres tissus racinaires chez le riz.
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