Identification moléculaire des isolats au niveau de l’espèce

Les extractions d’ADN ont été réalisées sur des cultures pures obtenues après 48 h d’incubation à 30°C.

II.4.3.1 Extraction de l’ADN par choc thermique

Une colonie a été déposée dans un micro-tube contenant 50 µL d’eau moléculaire stérile. Ce tube a été porté à ébullition pendant 10 min puis immédiatement mis pendant 10 min à -20°C.

II. 4.3.2 Pré-identification des BAL par PCR

Une pré-identification des BAL a été réalisée à l’aide d’amorces : LAC1 (5’- AGC AGT AGG GAA TCT TCCA – 3’) et LAC2 (5’- ATT YCA CCG CTA CAC ATG – 3’) spécifiques aux genres Lactobacillus, Pediococcus, Weissella, et Leuconostoc. Ces amorces permettent d’amplifier une séquence de 340 pb au sein du gène de l'ARNr 16S (Walter et al. 2001). L’amplification a été réalisée dans un volume réactionnel de 50 µL (Tableau 14) selon le programme suivant : une dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min, puis 35 cycles incluant une dénaturation à 94°C pendant 30 sec, l’hybridation des amorces à 55 °C pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 1 min et enfin une élongation finale de 5 min à 72°C.

101 Tableau 14 : Composition du volume réactionnel de la PCR pour la pré-identification des BAL.

*Concentration initiale des amorces à 10 µM

Après amplification, 5 µL d’ADN ont été mélangés avec 2 µL de colorant bleu/orange 6X (Promega) comprenant l’intercalant d’ADN GelRed (Biotium) puis analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % avec du tampon TAE 1X afin de vérifier l’amplification. La taille des fragments d’ADN a été estimée à l’aide du marqueur de poids moléculaire 100 pb (Promega).

Après migration à 100 V pendant 30 min, le gel a été visualisé puis photographié de la même manière que précédemment (II.3.1.2).

II. 4.3.3 Identification des BAL et BAA par amplification et séquençage du gène de l’ARNr 16S

La quasi-totalité du gène de l’ARNr 16S (1500 pb) a été amplifié par PCR à l’aide des amorces

27 F (5’- GTGCTGCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG– 3’) et 1492 R (5’-

CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT – 3’) (Marchesi et al. 1998) avec un mélange réactionnel de 50 µL (Tableau 14 modifié pour les amorces). Une première étape de dénaturation initiale de 3 min à 94°C a été réalisée suivie de 35 cycles incluant une dénaturation de 30 sec à 94°C, 30 sec à 55°C pour l’hybridation des amorces et 30 sec à 72°C pour l’élongation et enfin une étape d’élongation terminale de 5 min à 72°C.

Ensuite, après vérification de l’amplification par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % avec du tampon TAE 1X pendant 30 min à 100 V, les produits PCR ont été envoyés pour séquençage Sanger (Genseq, Montpellier). Les séquences d'ADN sens et anti-sens ont été analysées et corrigées à l'aide du logiciel Sequence Scanner v1.0 Software (Applied Biosystems) puis le

Réactif Volume* Concentration finale

GoTaq® Reaction Buffer (Promega) 10 µL 1X

dNTP (Promega) 1 µL 200 µM pour chaque dNTP

Amorce LAC1 (Sigma)* 10 µl 0,2 µM

Amorce LAC2 (Sigma)* 10 µL 0.2 µM

GoTaq® G2 DNA Polymerase (Promega) 0.25 µL 1.25 unités/réaction Extrait d’ADN par choc thermique 5 µL

102 logiciel Geneious Prime ® 2019.0.4 Build 2018, restricted version (Invitrogen Corporation) nous a permis d'obtenir la séquence complète. Les séquences ont été alors comparées avec la base de données Genbank à l'aide du programme Blastn (Altschul, 1997) sur le site web du NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

II.5 Analyse de la diversité intra spécifique des BAA isolées lors des

fermentations de cacao

II.5.1 Analyse du polymorphisme génomique : PCR sur séquences répétées

Afin d‘analyser le polymorphisme génomique, la méthode basée sur l’amplification de régions situées entre des séquences répétées (rep-PCR) a été utilisée. Ces séquences répétées sont présentes en de nombreuses copies et hautement conservées dans les génomes, ce qui permet d’obtenir des profils génomiques pour chaque souche (Versalovic et al. 1991). Il existe différentes séquences répétées retrouvées dans le génome bactérien : les séquences REP (Repetitive Extragenic Palindromic element), les séquences ERIC (Enterobacterial repeated Intergenic Consensus) les BOX éléments, et la séquence (GTG)5 (Tableau 15).

Tableau 15 : Listes des amorces utilisées pour l'analyse par PCR sur séquences répétées (Versalovic et al. 1994).

Amorces Séquences (5’-3’) Température d’hybridation REP1R-I CGICGICATCIGGC 40 °C REP2-I CGNCGNCATCNGGC ERIC1R ATGTAGATCCTGGGGATTCAC 52 °C ERIC2 AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG Box1AR CTACGGCAAGGCGACGCTGACG _{52 °C} (GTG)5 GTGGTGGTGGTGGTG 40°C

II.5.1.1 PCR sur séquences répétées : ERIC-PCR, REP-PCR, Box-PCR, (GTG)5-PCR

Dans un volume réactionnel de 50 µL (Tableau 16), des amplifications par PCR à l’aide d’amorces qui ciblent un type de séquences répétées ont été réalisées selon le programme suivant : une première étape de dénaturation initiale de 5 min à 95°C suivie de 30 cycles de 30 sec à 90°C pour la dénaturation, 30 sec à 40°C ou 52°C (selon le type d’amorces, Tableau

103 15) pour l’hybridation des amorces, 4 min à 65°C pour l’élongation et enfin une étape d’élongation terminale de 8 min à 65°C (Gonzalez et al. 2004). Après migration à 100 V pendant 1h30, le gel a été immergé 1 h dans une solution de Gelred dilué dans du TAE 1X. Les profils ont été visualisés et photographiés de la même manière que précédemment (II.3.1.2) puis enregistrés en format .TIFF en négatif.

Tableau 16 : Composition du mélange réactionnel pour l’analyse par PCR sur séquences répétées

Réactif Volume Concentration finale

Master Mix (Promega) 25 µL 1X

Amorces rep* 10 µl 2 µM

Extrait d’ADN par choc thermique 1 µL 10 ng

DMSO 5 µL 10 % (v/v)

Eau ultra pure qsp 50 µL

* Concentration initiale des amorces 100 µM

II.5.1.2 PCR Multiplexe sur séquences répétées (Box1AR, ERIC, REP)

Un test comparatif a été réalisé en utilisant la méthode de multiplexe, avec 3 jeux d’amorces de séquences répétées différentes : Box1AR, ERIC et REP (Tableau 15). Dans un volume réactionnel de 50 µL (Tableau 16) avec une concentration en amorces de 0,2 µM et de DMSO à 3,5 % (v/v). Les séquences ont été amplifiées par PCR selon le programme suivant : une première étape de dénaturation initiale de 3 min à 95°C suivie de 30 cycles de 30 sec à 90°C pour la dénaturation, 1 min à 40°C pour l’hybridation des amorces et 4 min à 72°C pour l’élongation et enfin une étape d’élongation terminale de 16 min à 72°C (Dupont et al. 2015).

Ensuite, les produits PCR ont été mis à migrer sur gel d’agarose à 1,5 % dans du TAE 1X pendant 1h30 puis dans un bain de gel red + TAE 1X pendant 1 h. Les profils ont été observés comme précédemment (II.3.1.2).

II.5.1.3 Analyse des profils génomiques

Les photos des gels ont été analysées à l’aide du logiciel CLIQS version 1.2.0.044 (Totallab, UK). Le logiciel détecte automatiquement les bandes présentes pour chaque échantillon, une

104 correction manuelle peut être nécessaire et génère les fronts de migration (Rf). Chaque bande a sa valeur de Rf, position donnée sur le gel. Le logiciel permet de réaliser une normalisation des Rf entre différents gels d’électrophorèses pour pouvoir les comparer entre eux.

Les PCR ont été réalisées en dupliquât pour chaque souche, afin de s’assurer de la reproductibilité de la méthode. Seules les bandes qui étaient partagées entre les deux amplifications ont été conservées pour obtenir le profil numérique de chaque souche et ainsi réaliser l’analyse statistique.

L’absence et la présence de bandes à différentes positions du gel (Rf) a été notée 1 (présence) et 0 (absence) pour chaque souche afin de réaliser une matrice en deux dimensions en code binaire. Ensuite, à l’aide du logiciel Rstudio, une matrice de distance a été réalisée en calculant l’indice de Sørensen-Dice, qui est un indice qui mesure la similarité entre deux échantillons en tenant compte de la présence ou de l’absence des bandes. A partir de cette matrice un dendrogramme a été construit par la méthode UPGMA (Unweighted Pair-Wise Grouping with Mathematical Averages) pour établir le regroupement des souches. Une analyse multivariée de la variance par permutations (PERMANOVA/ Adonis) a été effectuée afin de déterminer quelles variables qualitatives (jour de fermentation, pays d’origine) ont un impact sur le regroupement des souches.

D’autres tests statistiques ont été utilisés, Shapiro-Wilk (test de normalité) et ANOVA et test de Student (comparaisons de moyennes).