Identification des BAA et BAL

L’identification au niveau de l’espèce a été obtenue à l’aide de l’amplification et du séquençage du gène de l’ARNr 16S (1500 pb).

Identification des BAA

Le séquençage du gène de l’ARNr 16S a été réalisé sur les 149 souches potentielles de BAA et nous a permis d’obtenir des séquences allant de 1000 à 1404 pb (Annexe 1). Un fort pourcentage d’identité (id % > 99) a été obtenu avec les séquences présentes dans Genbank. Elles ont été identifiées comme des BAA. Ces résultats montrent que la stratégie employée au cours de cette étude est adaptée pour l’isolement des BAA.

Les souches de BAA ont été affiliées aux genres Acetobacter (n = 141) et Gluconobacter (n = 8). Parmi les souches d’Acetobacter, A. pasteurianus est l’espèce la plus fréquemment isolée avec 77 % des isolats, suivi de A. tropicalis, A. ghanensis, A. fabarum et A. orientalis, qui représentent respectivement 11 %, 5 %, 1,5 % et 1,5 % du total des isolats d'Acetobacter (Figure 50). Six souches d'Acetobacter (4 %) n’ont pas pu être affiliées au niveau de l'espèce. Effectivement, le gène de l’ARNr 16S d’A. cerevisiae et d’A. malorum sont très proches génétiquement et la taille de la séquence de l'ARNr 16S est insuffisamment informative pour les différencier (Valera et al. 2013). Pour les souches appartenant au genre Gluconobacter, 7 souches ont été identifiées comme Gluconobacter oxydans et une comme Gluconobacter nephelii.

160 Tableau 25: Répartition des 149 isolats de BAA selon les trois pays (Côte d'Ivoire, Guyane et Mexique).

Pays Côte d’Ivoire Guyane Mexique

Identification des

espèces bactériennes Total 2016 2018

Grande récolte Petite récolte A. pasteurianus 108 35 15 12 15 31 A. tropicalis 16 5 2 2 5 2 A. fabarum 2 1 1 A. ghanensis 7 5 2 A. orientalis 2 2 A. malorum / A. cerevisiae 6 6 Gluconobacter sp 8 2 6 Sous total 48 21 19 39 Total 149 68 22 59

Figure 50 : Graphique résumant la distribution des isolats au sein des espèces appartenant au genre Acetobacter.

161 Le Tableau 25 présente la répartition des souches de BAA selon les pays d’origine. Parmi les 149 isolats de BAA, 68 souches ont été isolées à partir de fermentations en Côte d'Ivoire, 59 souches de fermentations au Mexique et 22 souches de Guyane. Globalement, les souches d'A. pasteurianus et d'A. tropicalis ont été retrouvées dans les fermentations des 3 pays. En revanche, les souches d'A. fabarum et A. ghanensis n'ont été isolées qu'en Côte d'Ivoire ; A. orientalis n’a été isolée qu’en Guyane, A. cerevisiae / malorum qu’au Mexique. Les souches de Gluconobacter sp n’ont été isolées qu’en Côte d'Ivoire et qu’en Guyane.

Les espèces d’Acetobacter ont été fréquemment isolées lors de fermentations du cacao à travers les différents pays producteurs. L’inventaire de la diversité des BAA réalisé au cours de la thèse et résumé dans le tableau 3 (Etat de l’art - I.6.2.3) montre que l’espèce A. pasteurianus a été l’espèce majoritairement isolée des fermentations de cacao au Brésil, Cameroun, Côte d’Ivoire, Equateur, Ghana, Malaisie, République Dominicaine, Australie, Bolivie et au Honduras (Ardhana, 2003; Camu et al. 2007, 2008; Papalexandratou et al 2011a,2011b,2011c; Ho et al. 2014a, 2015, ; Magalhães da Veiga Moreira et al. 2016; Miescher Schwenninger et al. 2016; Mota-Gutierrez et al. 2018; Romanens et al. 2018) suivie de A. ghanensis, A. fabarum, A. tropicalis. Les espèces A. cerevisiae ou A. malorum ont été peu fréquemment isolées lors des fermentations de cacao dans des pays où la production de cacao est faible notamment au Honduras (Romanens et al. 2018), Brésil (de Melo Pereira et al. 2013) et en Equateur (Papalexandratou et al. 2011c).

Identification des BAL

Le séquençage du gène de l’ARNr 16S a été réalisé sur les 63 souches potentielles de BAL et nous a permis d’obtenir des séquences allant de 725 à 1414 pb (Annexe 2). Un fort pourcentage d’identité (id % > 97) a été obtenu avec les séquences présentes dans la Genbank. Elles ont été identifiées comme des BAL.

L. plantarum est l’espèce la plus fréquemment isolée avec 87 % des isolats, suivie de Leuconostoc pseudomesenteroides, Lactobacillus brevis, Fructobacillus tropaeoli, Pediococcus acidilactici et Lactobacillus paracasei/ rhamnosus qui représentent respectivement 3 %, 3 %, 3 %, 2 % et 2 % du total des isolats de BAL (Figure 51).

162 Tableau 26 : Répartition des 63 isolats de BAL selon les trois pays (Côte d'Ivoire, Guyane française et Mexique).

Pays Côte d’Ivoire Guyane Mexique

Identification des

espèces bactériennes Total 2018 2017

Grande récolte Petite récolte L. plantarum 55 18 3 8 26 Leuconostoc pseudomesenteroides 2 2 L. brevis 2 2 Fructobacillus tropaeoli 2 2 Pediococcus acidilactici 1 1 L. paracasei/ rhamnosus 1 1 Sous total 11 26 Total 63 19 7 37

Le Tableau 26 présente la répartition des souches de BAL selon les pays d’origine. Parmi les 63 isolats de BAL, 19 souches ont été isolées à partir de fermentations de Côte d'Ivoire, 37 souches

Figure 51: Graphique résumant la distribution des isolats au sein des différents genres et espèces de BAL.

163 à partir de fermentations au Mexique et 7 souches à partir de fermentations en Guyane. Seules, les souches de L. plantarum ont été retrouvées dans les fermentations des 3 pays. Cependant, les souches de Leuconostoc pseudomesenteroides et Fructobacillus tropaeoli n’ont été isolées qu'en Guyane; L. brevis et L. paracasei/ rhamnosus qu’au Mexique et Pediococcus acidilactici qu’en Côte d’Ivoire.

Ces espèces ont été déjà identifiées comme intervenants dans la fermentation des fèves de cacao, d’après l’inventaire de la diversité des BAL (Tableau 4- I.4.3.3). L. plantarum est l’une des espèces majoritairement identifiées comme dominant les fermentations au Brésil, Cameroun, Côte d’Ivoire, Equateur, Ghana, Malaisie, République Dominicaine, Australie, Bolivie et au Honduras (Ardhana, 2003; Camu et al. 2007, 2008; Papalexandratou et al 2011a,2011b,2011c; Ho et al. 2014b, 2015, ; Magalhães da Veiga Moreira et al. 2016; Miescher Schwenninger et al. 2016; Mota- Gutierrez et al. 2018; Romanens et al. 2018).

III.3.1.4 Conclusion partielle

Cette partie a mis en évidence l’importance du conditionnement des échantillons de fèves de cacao pour l’isolement des BAA et BAL. Il a été nécessaire d’avoir des échantillons frais de fèves de cacao avec la pulpe encore présente autour afin d’optimiser l’isolement. La collection de souches a été réalisée à partir d’échantillons frais de fèves de cacao en provenance de trois zones géographique le Mexique, La Côte d’Ivoire et la Guyane.

Notre stratégie d’isolement des souches s’est avérée efficace, car toutes les souches isolées à l’aide des milieux spécifiques ont été identifiées comme des souches de BAA et BAL. Cependant, la stratégie employée pour l’isolement des BAL comporte plusieurs biais pour l’isolement des espèces minoritaires. Seuls les bacilles à Gram positif ont été sélectionnés et les coccis à Gram positif n’ont pas été pris en compte pour la réalisation de la collection de souches de BAL. L’utilisation des amorces spécifiques à 4 genres (Weissella, Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus de BAL pour la pré-identification ne permet pas d’accéder à la totalité des genres de BAL.

164 A. pasteurianus et L. plantarum sont les espèces majoritairement isolées des fermentations de fèves de cacao à travers les 3 zones géographiques, avec 107 isolats soit 73 % du total de souches isolées pour A. pasteurianus et 55 isolats soit 87 % du total des souches de BAL isolées pour L. plantarum. Ce résultat est en adéquation avec les données de la littérature, A. pasteurianus et L. plantarum étant les espèces majoritaires, dominant les fermentations et formant le consortium microbien. L’espèce A. tropicalis a aussi été retrouvée dans les 3 zones mais à un plus faible pourcentage (11 %) soit 16 souches.

Pour la suite de l’étude, nous avons décidé de nous intéresser à l’analyse de la diversité intraspécifique des souches d’A. pasteurianus et d’A. tropicalis qui sont les espèces retrouvées majoritairement dans les fermentations de fèves de cacao des trois pays échantillonnés.

III.3.2 Analyse de la diversité intraspécifique des souches d’A. pasteurianus