2.1 Hypothèses soutenant le projet de recherche
La formation d’amyloïdose pancréatique est un problème associé au diabète de type 2 en médecine humaine et au diabète mellitus en médecine vétérinaire. Au cours de la dernière décennie, des efforts massifs en recherche et développement ont été déployés afin de mieux comprendre la physiopathologie et de trouver des thérapies pharmacologiques applicables à l’amyloïdose pancréatique. Les travaux qui émergent du développement d’agents anti- amyloïdogéniques sont complémentaires aux travaux de recherches qui visent à détailler les mécanismes physiopathologiques. Ils contribuent également à mieux comprendre les mécanismes qui sont impliqués dans le processus de la formation de l’amyloïde. De nouvelles stratégies de traitement ont fait leur apparition afin d’entraver la formation des agrégats fibrillaires. La disponibilité des structures détaillées des différents agrégats offrira l’opportunité future d’adopter une approche beaucoup plus standard qui s’apparente à celle du développement classique d’un inhibiteur. De plus, le mécanisme de la formation fibrillaire étant très complexe, il ne s’agit pas seulement de stabiliser la structure de la protéine d’origine ou les oligomères, mais d’empêcher les interactions avec les peptidoglycanes de la matrice extra-cellulaire, les membranes cellulaires ou les protéines qui se lient à l’amyloïde. De nouvelles technologies biochimiques et physicochimiques permettent l’utilisation de petits peptides et de l’immunothérapie. Ces approches moléculaires bien pensées permettent respectivement de former un “capuchon” sur la fibrille, de modifier la conformation de la protéine ou de pieger le monomère fibrillaire (Porat et al., 2006; Hard et Lendel, 2012; Cheng et al., 2013a). Certains de ces outils pharmacothérapeutiques préliminaires semblent démontrer une efficacité dans les modèles in vitro et dans certains cas, in vivo (Porat et al., 2006; Hard et Lendel, 2012; Cheng et al., 2013a). Quelques agents sont actuellement en étude clinique afin de démontrer leur efficacité et leur applicabilité dans la médecine thérapeutique (Porat et al., 2006; Hard et Lendel, 2012; Cheng et al., 2013a). Toutefois, l’exploration de
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différents outils moléculaires demeure essentielle afin d’augmenter les connaissances physiopathologiques sur l’amyloïdose pancréatique et de déterminer certains éléments des relations structure-activité régissant l’activité anti-amyloïdogénique requise pour abroger les dépôts d’amyloïde pancréatique.
Les hypothèses du projet sont que certaines variations critiques présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales sont impliquées, en partie, dans la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde.
De nos constats, les deux avenues de recherche suivantes émergent :
1) L’étude d’une variété d’isoformes de l’IAPP provenant de différentes espèces animales et leur propension à former des dépôts d’amyloïde;
2) L’étude des relations structure-activité de diverses classes pharmacologiques dans le but d’abroger la formation d’amyloïde pancréatique.
2.2 Objectifs du projet de recherche
L’objectif principal du projet de recherche consiste à apporter de nouveaux outils moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la formation de l’amyloïdose pancréatique. Il implique le développement et la validation de nouvelles approches thérapeutiques in vitro de l’amyloïdose pancréatique. Les objectifs spécifiques sont présentés en deux sections.
Objectif 1 : Séquencer le gène de l’IAPP chez plusieurs espèces animales, évaluer le potentiel d’amyloïdogénicité des isoformes et identifier les variations en acides aminés critiques pour la formation de l’amyloïde pancréatiques.
La formation de fibrilles dans le pancréas contribue à la pathogénèse du diabète mellitus chez les humains, les félins et les macaques (Westermark et al., 2011). Le gène de l’IAPP a été isolé et séquencé chez plusieurs espèces animales, notamment le cougar (Felis
concolor), la vache (Bos taurus), le poulet (Gallus gallus), le cochon d’Inde (Cavia porcellus),
le hamster (Mesocricetus auratus), le furet (Mustela putorius), la souris (Mus musculus), le lapin (Oryctolagus cuniculus), le raton laveur (Procyon lotor) et le rat (Rattus norvegicus)
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(Johnson et al., 1991; Fan et al., 1994; Jordan et al., 1994; Yoshikawa et al., 1999; Paulsson et al., 2011; Westermark et al., 2011). Les dépôts d’amyloïde ont été observés dans les îlots de Langerhans chez les humains, les primates non humains, les félins et les grands félins (Johnson et al., 1991; Westermark et al., 2011). Néanmoins, les dépôts d’amyloïde n’ont pas été rapportés chez toutes les espèces animales et l’implication des agrégats fibrillaires dans la pathogénèse du diabète mellitus est variable dans le règne animal. Le dépôt d’amyloïde pancréatique a été rapporté dans quelques cas d’insulinome chez le chien (Canis lupus
familiaris), mais ces derniers ne sont pas impliqués dans la pathogénie du diabète canin
(O’Brien et al., 1987; O’Brien et al., 1990). Les mécanismes qui induisent la conversion de l’IAPP en amyloïde sont certes multifactoriels; en revanche, les détails ne sont pas complètement élucidés.
L’objectif 1 implique le séquençage d’une partie du gène de l’IAPP chez plus d’une trentaine d’espèces animales, l’évaluation des différents homologues peptidiques à former des agrégats fibrillaires et la comparaison des séquences peptidiques afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale. Le potentiel d’amyloïdogénicité des différentes séquences d’acide aminé chez chaque espèce animale a été comparée à l’aide d’analyses in silico. Afin de poursuivre les essais in vitro, des peptides synthétiques s’inspirant des séquences peptidiques obtenues chez les différentes espèces animales ont été commandées afin de procéder à des études in vitro sur la formation des agrégats d’amyloïdes. Le potentiel d’agrégation fibrillaire des séquences peptidiques a été déterminé avec la fluorescence à la thioflavine T et l’essai de liaison au rouge Congo. La conversion des structures secondaires en feuillet β a été analysée à l’aide de la spectrométrie de l’UV lointain via le dichroïsme circulaire pour chaque peptide. La microscopie électronique a été employée afin de confirmer l’absence ou la présence de fibrilles. Les essais de cytotoxicité ont été réalisés sur la lignée cellulaire pancréatique de rat INS-1. Le chapitre III se consacre à l’étude des variations en acides aminés requises pour enfreindre la conversion de l’état natif de la protéine IAPP en agrégat fibrillaire. Ce chapitre est en lien avec la première hypothèse énoncée.
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Objectif 2 : Abroger la formation de fibrilles d’amyloïde pancréatique humaine (hIAPP) par l’utilisation de composés chimiques contenant des groupements aromatiques et urées.
L’objectif 2 comporte l’évaluation du potentiel inhibiteur de l’agrégation fibrillaire de l’IAPP humaine (hIAPP) de trois différentes classes pharmacologiques, soit les hypoglycémiants, les anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS), et les aryles éthyles urées (EU). Plusieurs composés chimiques de la famille des polyphénols, comme les flavonoïdes, la curcumine, le resvératrol et la silibinine, ont démontré un potentiel à inhiber la formation d’amyloïde in vitro et ont aussi un effet protecteur sur les cultures cellulaires pancréatiques (Daval et al., 2010; Jiang et al., 2011; Cao et Raleigh, 2012; Cheng et al., 2012; Hard et Lendel, 2012). Toutefois, des composés plus puissants, présentant à la fois des propriétés adéquates concernant la biodisponibilité (absorption, premier passage hépatique) et une efficacité in vivo, sont à développer (Chow et al., 2005; Yang et al., 2007; Muzzio et al., 2012). Les molécules qui contiennent des groupements chimiques tels que des noyaux aromatiques, des polyphénols et des urées sont potentiellement des agents efficaces afin d’empêcher la formation de dépôts d’amyloïde (Daval et al., 2010; Jiang et al., 2011; Cao et Raleigh, 2012; Cheng et al., 2012; Hard et Lendel, 2012; Seeliger et al., 2013).
Pour l’étude des relations structure-activité de dérivés aryles éthyles urées (EU), la préparation et la synthèse des molécules ont été effectuées dans le cadre de mes travaux de maîtrise sous la supervision du Dr René C.-Gaudreault à l’Université Laval (Fortin et al., 2007, 2008). Les relations structure-activité des trois différentes classes pharmacologiques ont été décrites principalement en fonction de l’influence de chaque représentant des différentes classes pharmacologiques sur la formation des fibrilles par l’essai fluorimétrique à la thioflavine T, le changement de conformation de structure secondaire par la spectrométrie de l’UV lointain via le dichroïsme circulaire, l’oligomérisation de la protéine par l’essai de la liaison croisée photo-induite et la viabilité cellulaire. L’efficacité des différents composés inhibiteurs de l’agrégation fibrillaire de l’IAPP a été testée sur l’hIAPP qui possède un fort potentiel à former des dépôts d’amyloïde.
Les molécules possédant une activité anti-amyloïdogénique ont été testées sur des lignées cellulaires provenant d’insulinome de rat (INS-1) ou de souris (MIN-6) afin d’évaluer
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leur potentiel à protéger les cellules contre la cytotoxicité des fibrilles formées par l’hIAPP. L’évaluation de la survie cellulaire a été effectuée par une méthode fluorimétrique, à la résazurine. Les chapitres IV, V et VI se consacrent à l’étude des relations structure-activité requises pour l’inhibition de l’agrégation fibrillaire de l’IAPP. Ces chapitres sont en lien avec la deuxième hypothèse énoncée.